細胞焦亡參與早期子鼠壞死性小腸結腸炎的發(fā)病

王 靜 ，米弘瑛 ，張 熠 ，李 麗 ，余建華 ，劉麗巧 ，劉慶瑜 ，王立偉

（1）大理大學臨床醫(yī)學院，云南 大理 671003;2）云南省第一人民醫(yī)院兒科，云南 昆明 650032;3）昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650032;4）云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，云南 昆明 650032;5）昆明理工大學臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650032）

新生兒壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒常見的消化道疾病，臨床上以腹脹、嘔吐、便血為主要表現，嚴重者可發(fā)生消化道穿孔、彌漫性腹膜炎、休克、多器官功能衰竭[1-3]。NEC 發(fā)病的基本機制是腸道炎癥反應，近年來關于NEC 發(fā)病機制的研究成為熱點，但至今尚未闡述清楚。有研究者發(fā)現，細胞焦亡（Pyroptosis）的關鍵分子在NEC 中會明顯升高，如白細胞介素（interleukin，IL）-1β、白細胞介素（interleukin，IL）-18、天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1、消皮素 D（gasdermin D，GSDMD）等，從而證實了細胞焦亡參與NEC 的發(fā)病[4-6]。但是這些關鍵分子蛋白是否會在早期NEC 中明顯升高，值得進一步實驗論證。

1 材料與方法

1.1 NEC 動物模型建立及分組

以新出生的子鼠為研究對象，買懷孕14 d 的SD 孕鼠，購自昆明理工大學動物實驗中心，孕鼠在動物房適應7 d 左右后待其自然生產。將新出生的子鼠按照完全隨機分組方法，分為實驗組和對照組。對照組子鼠15 只，與母鼠同籠，由母鼠以鼠乳喂養(yǎng)，待其自然生長，不做任何處理。最終選取12 只正常子鼠納入實驗對象。

實驗組子鼠20 只，運用缺氧、喂養(yǎng)不當、寒冷刺激等處理誘導子鼠發(fā)病，將子鼠放置在缺氧培育箱中，缺氧箱內氣體是5%氧氣混合95%氮氣，每天缺氧處理3 次，每次10 min，連續(xù)處理3 d，間隔期將子鼠放置4 ℃的冰箱進行寒冷刺激，同樣是每天進行3 次，每次10 min，連續(xù)處理3 d，誘導過程中以鼠乳代用品人工喂養(yǎng)[7-8]。排除死亡子鼠，將實驗組出現活動能力減少、反應變差、攝食減少、腹脹、胃潴留的子鼠定義為早期NEC 模型子鼠，共計12 只，并納入實驗對象。

1.2 診斷標準

本次研究早期NEC 小鼠模型的定義參考新生兒早期NEC 的診斷標準[9-10]，前期通過對臨床上早期NEC 患兒糞便隱血陽性率統(tǒng)計，研究結果提示早期NEC 出現糞便隱血的陽性率不高[11]，故建模中無論子鼠糞便有無肉眼血絲均視為建模成功，上述子鼠的癥狀與臨床中新生兒早期NEC 癥狀基本一致。

1.3 蛋白濃度的測定

將所有建模成功的子鼠處以安樂死，立即抽取處以安樂死子鼠的血液于收集管中，小心分離出血清，置于-80 ℃冰箱中保存。Elisa 試劑盒由睿信生物公司提供，分別是IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等3 個試劑盒，按照試劑盒的說明書步驟測定血清中目標蛋白分子的吸光度，通過樣本的吸光度（OD 值），利用方程計算血清中蛋白分子的濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理

本次研究采用隨機對照的研究方法，用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，由于蛋白分子濃度總體分布不明，需進行正態(tài)性檢驗，經S-W 檢驗以及直方圖結果顯示，各組數據不服從正態(tài)分布，因此數據不滿足正態(tài)分布，故運用秩和檢驗對上述蛋白分子進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 實驗組與對照組子鼠腸道形態(tài)變化

2 組子鼠腸道組織肉眼觀察所示：實驗組子鼠的腸道在開腹時呈現出腸管 明顯積氣增粗，取出后如圖1A 所示部分腸壁顏色變暗，出現缺血樣改變，腸腔內有較多血性液體積聚，腸曲形態(tài)自然，腸壁光滑，并未出現明顯壞死及串珠樣改變；對照組子鼠的腸道在開腹時并無積氣表現，取出后如圖1B 所示腸管呈淡黃色，腸腔內無血性液體積聚，腸曲形態(tài)自然，腸壁光滑。

圖1 2 組子鼠腸道組織肉眼觀察Fig.1 Macroscopic observation on intestinal tissue of two groups of rats

2.2 血清中Gasdermin D 的濃度分析

用Gasdermin D Elisa 試劑盒檢測2 組子鼠血清中Gasdermin D 蛋白分子的濃度，實驗組Gasdermin D 濃度的中位數為1.200 0（1.060 0，1.522 5），對照組中位數為1.010 0（0.762 5，1.092 5），運用秩和檢驗統(tǒng)計分析方法，結果提示P為0.017，差異有統(tǒng)計學意義，可認為實驗組子鼠血清中Gasdermin D 的濃度高于對照組，見表1，圖2。

表1 2 組子鼠血清中Gasdermin D 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of serum Gasdermin D concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

圖2 2 組血清中Gasdermin D 的濃度分布（ng/mL）Fig.2 Concentration distribution of Gasdermin D in serum of two groups（ng/mL）

2.3 血清中Caspase-1 的濃度分析

2 組子鼠血清中Caspase-1 蛋白分子的濃度，實驗組Caspase-1 濃度的中位數為4.090 0（3.117 5，4.917 5），對照組中位數為2.255 0（1.992 5，2.900 0），運用秩和檢驗統(tǒng)計分析方法，結果提示P＜ 0.001，差異有統(tǒng)計學意義，可認為實驗組子鼠血清中Caspase-1 的濃度高于對照組，見表2，圖3。

圖3 2 組血清中Caspase-1 的濃度分布（ng/mL）Fig.3 Concentration distribution of Caspase-1 in serum of two groups（ng/mL）

表2 2 組子鼠血清中Caspase-1 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of Caspase-1 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

2.4 血清中IL-18 的濃度分析

與上述Gasdermin D 及Caspase-1 統(tǒng)計結果不同，用試劑盒檢測兩組子鼠血清中IL-18 蛋白分子的濃度，實驗組IL-18 濃度的中位數為 9.305 0（8.335 0，10.200 0），對照組中位數為8.910 0（8.147 5，10.042 5），秩和檢驗統(tǒng)計分析結果提示P為0.755，差異無統(tǒng)計學意義，即實驗組子鼠血清中IL-18 的濃度與對照組無明顯差異，見表3，圖4。

圖4 2 組血清中IL-18 的濃度分布（ng/mL）Fig.4 Concentration distribution of IL-18 in serum of two groups（ng/mL）

表3 2 組子鼠血清中IL-18 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of IL-18 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

3 討論

NEC 是新生兒最嚴重的消化道疾病，實質是腸道炎癥反應，與腸道菌群失調、喂養(yǎng)不耐受、腸道粘膜屏障受損、免疫力低下、感染、缺血缺氧等因素密切相關[12-15]，主要累及遠端小腸和近端結腸[16]，中性粒細胞廣泛浸潤導致穿孔、腹膜炎、全身性膿毒癥和多器官衰竭等危及患兒生命，發(fā)病機制過于復雜，目前認為是免疫系統(tǒng)的過度炎癥反應，引起劇烈的炎癥風暴，導致腸道通透性增加、細菌移位和炎癥，但是具體機制尚不明確[17-18]。

近年來，NEC 的炎癥機制已然成為國內外學者的研究熱點，有研究者發(fā)現細胞焦亡這一特殊的細胞死亡方式，參與NEC 的發(fā)病。細胞焦亡是一種細胞程序性死亡的方式，而Gasdermin D 是炎癥細胞死亡的核心蛋白分子，Gasdermin D 發(fā)揮有賴于被活化的Caspase-1、Caspase-11 及人類同源的Caspase-4/5 等切割成有活性的N-端結構域和無活性的C-端結構域，有活性的N-端結構與細胞膜上特定的磷脂分子結合，介導非離子選擇性孔道的形成，將細胞內IL-18 等炎癥介質釋放至細胞外[19-23]。因此，當機體發(fā)生細胞焦亡時，血清中IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等蛋白分子的濃度會出現升高。

既往研究者通過建立動物模型探討NEC 的發(fā)病機制[24]，致力于發(fā)現對NEC 診斷具有較高敏感度及特異性的生物蛋白分子[25-26]，在研究過程中證實細胞焦亡參與NEC 的發(fā)病，但是具體的信號通路仍在進一步研究，同時提出Gasdermin D、Caspase-1 的發(fā)現有望為NEC 的抗炎治療提供新的方向[27-28]。本次研究著力于早期NEC 的發(fā)病機制，通過建立與早期臨床癥狀相符的動物模型，探討IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等細胞焦亡的關鍵分子蛋白是否會在早期NEC 中明顯升高，并且希望通過本次研究，發(fā)現適用于NEC 早期診斷的特異性分子蛋白，從而達到提高早期診斷率、及時進行干預的目的[29-30]。

由于早期NEC 患兒腸道炎癥較輕，診斷依據主要為臨床表現及體征，而實驗室檢查及影像學檢查均無明顯特異性，在治療上通常采取內科治療方式，因此本次研究基于與臨床相符原則，參照早期NEC 的臨床癥狀建立早期NEC 動物模型，以癥狀為主要建模成功標準，并未對腸道組織進行組織病理學形態(tài)分析。在建模過程中，新生子鼠的活動能力、喂養(yǎng)情況、一般反應均變差，并出現腹脹癥狀，在下一次喂養(yǎng)之前進行胃液回抽可見胃液殘留增多，將處以安樂死的子鼠剖開腹部可見腸管明顯充氣擴張，臨床上早期NEC 患兒的影像學征象主要以腸管積氣擴張為主，因此本次研究中的動物模型與早期新生兒NEC 臨床表現基本一致，并且從圖1 中A 圖所示，肉眼觀實驗組子鼠腸腔內可見血性液體增多，部分腸壁呈現缺血樣改變，也證實了實驗組子鼠腸道已經出現炎癥性損傷。

本次研究發(fā)現，Gasdermin D、Caspase-1 作為細胞焦亡的關鍵蛋白分子，在實驗組動物模型血清中的濃度出現升高，推斷這兩種蛋白分子在早期NEC 中就會出現升高，因此細胞焦亡在早期就參與NEC 的發(fā)病。Gasdermin D、Caspase-1 可能通過介導炎癥分子的逐級激活，參與炎癥的發(fā)生，導致腸道上皮細胞炎癥性損傷，并且可能成為NEC 靶向治療的特異性蛋白分子[31-32]，通過抑制這兩種蛋白分子活性，從而達到抑制炎癥逐級激活，減輕NEC 腸道炎癥反應。通常IL-18 作為Gasdermin D 的下游炎癥分子，理論上實驗組血清中的濃度應該高于對照組，而本次研究中IL-18 在兩組血清中的濃度無明顯差異，由于各炎癥分子之間相互激活途徑比較復雜，因此有待進一步深入研究證實。

綜上所述，本研究通過建立早期NEC 的動物模型，檢測血清中Gasdermin D、Caspase-1 等在早期NEC 中明顯升高，從而證實了細胞焦亡參與早期NEC 的發(fā)病，但是具體的參與機制有待以后各位學者繼續(xù)研究探索，并且Gasdermin D 及Caspase-1 在新生兒血清中正常的參考值范圍值得進一步明確，為臨床上早期NEC 的診斷及治療提供新的方向。