Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌OprD 基因突變分析

鄭 喜 ，馬金珠 ，李琴春 ，高 瑜 ，潘 穎 ，宋貴波

（1）云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650041;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科/云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，云南 昆明 650032）

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的非發(fā)酵革蘭陰性細(xì)菌，能夠引起肺部感染、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷創(chuàng)面感染等[1]。其耐藥機(jī)制復(fù)雜，對(duì)多種抗菌藥物具有固有耐藥性，從而使得可選擇用于治療相關(guān)感染的抗生素減少[2]。碳青霉烯類抗菌藥物在治療由銅綠假單胞菌引起的感染中起著重要作用[3]。但如今在中國(guó)的醫(yī)院中銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物有著較高的耐藥率，2019 年CHINET 三級(jí)醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)顯示銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別是27.5%和23.5%[4]。導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機(jī)制復(fù)雜，以往的研究報(bào)道[5]OprD基因的突變、插入和/或缺失是導(dǎo)致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的常見機(jī)制。本研究對(duì)銅綠假單胞菌中一種少見的耐藥表型：對(duì)碳青霉烯類耐藥而對(duì)頭孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的銅綠假單胞菌的OprD基因序列進(jìn)行分析，進(jìn)而對(duì)OprD基因突變情況進(jìn)行研究和探討。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

樣本收集來自2021 年1 月至2021 年3 月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院不同住院患者的痰、引流液、分泌物等標(biāo)本分離的非重復(fù)菌株10 株。經(jīng)質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）鑒定均為銅綠假單胞菌。經(jīng)Vitek 2 Compact 藥敏鑒定系統(tǒng)及配套的GN09藥敏板卡檢測(cè)為美羅培南、亞胺培南耐藥，頭孢他啶和頭孢吡肟敏感的分離株10 株，分別標(biāo)記為P1 至P10。將菌株分離培養(yǎng)后用滅菌的牛奶凍存管凍存。

1.2 主要儀器及試劑

Vitek 2 Compact 藥敏鑒定系統(tǒng)以及配套試劑GN09 藥敏板卡購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司、MH 瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物有限公司、哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物有限公司、藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司、電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司、DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司、質(zhì)譜儀購(gòu)自德國(guó)布魯克公司、PCR 儀購(gòu)自西安天隆科技公司、PCR 試劑購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司、凝膠成像儀購(gòu)自通用電氣（中國(guó)）醫(yī)療集團(tuán)公司。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用Vitek 2 Compact 自動(dòng)儀器法和紙片擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)?？股匕^孢他啶、亞胺培南、頭孢吡肟、美羅培南、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2020 年的折點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀[6]。以銅綠假單胞菌ATCC 27853 為質(zhì)控菌株。

1.4 OprD 基因擴(kuò)增

將凍存的菌株復(fù)融后用哥倫比亞血平板轉(zhuǎn)種備用。嚴(yán)格按照試劑盒廠家說明書提取細(xì)菌DNA。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：OprD-R：5'-GTCG ATTACAGGATCGACAG-3'；OprD-F：5'-CGCCG ACAAGAAGAACTAGC-3'，片段大小為1 412 bp。

聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系：50 μL。其中，Emerald Amp MAX PCR Master Mix（2×Premix）25 μL，引物OprD-F、OprD-R 各2 μL，無菌水16 μL，DNA 模板5 μL。PCR 反應(yīng)條件：（1）預(yù)變性：95×5 min；（2）循環(huán)：95 ℃×30 min，61 ℃×30 min，72 ℃×90 min，共30 個(gè)循環(huán)；（3）延伸：72 ℃×10 min；（4）4 ℃保存。產(chǎn)物電泳：用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳時(shí)間20 min。最后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并保存圖片。

1.5 PCR 產(chǎn)物測(cè)序

將獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序分析，并用DNAstar 序列分析軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸鏈，再與銅綠假單胞菌PAO1 菌株的OprD 蛋白序列作比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Car-R/Ceph-S 銅綠假單胞菌的耐藥特點(diǎn)

10 株受試菌株對(duì)亞胺培南和美羅培南均表現(xiàn)為耐藥，對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟和阿米卡星均表現(xiàn)為敏感。未發(fā)現(xiàn)對(duì)哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦耐藥的菌株，10 株菌株對(duì)哌拉西林中介率為20%（2/10），對(duì)哌拉西林/他唑巴坦中介率為10%（1/10）；對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率分別為：左氧氟沙星60%（6/10）、環(huán)丙沙星70%（7/10）、氨曲南30%（3/10）、慶大霉素10%（1/10）、妥布霉素20%（2/10）。PA 對(duì)各種抗生素的耐藥率，見表1。

表1 PA 對(duì)12 種抗生素的耐藥率（n=10）Tab.1 Resistance rate of PA to 12 antibiotics（n=10）

2.2 PCR 產(chǎn)物電泳

對(duì)10 株菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳顯示，所有菌株均出現(xiàn)明顯的OprD 條帶，10 株菌株中有6 株OprD 的條帶在1 500 bp 左右；而有4 株（P5、P6、P8、和P10）的OprD 電泳條帶大概在1 000 bp 左右，推測(cè)這4 株菌株可能存在大片段的缺失。10株菌株電泳條帶，見圖1。

圖1 10 株銅綠假單胞菌OprD 的擴(kuò)增條帶Fig.1 Amplified bands of OprD of 10 Pseudomonas aeruginosa strains

2.3 測(cè)序分析

10 株菌株經(jīng)測(cè)序后與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1 的序列比較分析后顯示有不同的突變類型：有2 株菌株（P1 和P2）因堿基缺失導(dǎo)致移碼突變；4 株菌株（P5、P6、P8 和P10）有大片段缺失，均為466～830 位點(diǎn)大片段缺失；2 株菌株（P3 和P9）提前出現(xiàn)終止密碼子。10 株菌株的具體突變類型及突變特征，見表2。

表2 10 株銅綠假單胞菌OprD 基因突變分析Tab.2 Analysis of OprD gene mutation in 10 strains of Pseudomonas aeruginosa

3 討論

10 株菌株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除了對(duì)亞胺培南和美羅培南均表現(xiàn)為耐藥，對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟均表現(xiàn)為敏感外，PA 對(duì)其余抗生素耐藥率為0%～70%，與2019 年CHINET[5]所報(bào)道的耐藥率4.6%～27.2%有較大差異，分析原因可能有以下2 點(diǎn)：（1）本研究在選擇菌株時(shí)有要求，必須是Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌；（2）與參與本次研究的菌株數(shù)量少有關(guān)。這些可能原因需要在以后的研究中增加菌株數(shù)量予以驗(yàn)證。電泳結(jié)果顯示10 株菌株均有明顯的OprD 條帶，未發(fā)現(xiàn)有OprD基因的完全缺失，這與李飛等[8]所報(bào)道的2.73%的缺失率有差異，可能是菌株數(shù)量少所致。

測(cè)序分析顯示：在10 株Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中OprD基因存在以下幾種類型的突變模式：一種是點(diǎn)突變，導(dǎo)致過早出現(xiàn)終止密碼子；第二種是移碼突變，插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸；最后一種是堿基片段的缺失。這與Lee JY 等[9]的報(bào)道相似。以往的研究報(bào)道[10]OprD基因的替換、缺失、插入或突變等變化可改變OprD 孔蛋白的構(gòu)象或抑制其存在，并產(chǎn)生對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性。Sherrard Laura J 等[11]也證實(shí)了OprD基因常見的突變都是導(dǎo)致PA 對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的重要因素。本研究中所有試驗(yàn)菌株均對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥，對(duì)所有試驗(yàn)菌株的OprD基因序列分析顯示：試驗(yàn)菌株的OprD基因中有堿基的缺失或突變，導(dǎo)致OprD基因中出現(xiàn)移碼突變或終止密碼子的提前出現(xiàn)，這與Hirabayashi 等[12]的研究一致。P4 菌株的OprD基因序列中有9 個(gè)氨基酸替代（T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A）與國(guó)內(nèi)的研究[13-14]一致。與此外本研究也發(fā)現(xiàn)了一些新的氨基酸替代突變（D43N S57E S59R V127L V359L）。結(jié)合對(duì)10 株Car-R/Ceph-S 銅綠假單胞菌OprD基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果和測(cè)序分析，筆者發(fā)現(xiàn)有4 株菌株（P5、P6、P8、P10）擴(kuò)增后條帶在1 000 bp 左右，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)4 株菌株均有466～830 位點(diǎn)大片段缺失以及3 個(gè)氨基酸替代（S57E S59R V127L）；所以，筆者推測(cè)466-830 位點(diǎn)大片段缺失以及3 個(gè)氨基酸的替代可能是導(dǎo)致該表型的2 種重要突變，并且是同時(shí)發(fā)生的。在本研究中，有8 株菌株OprD基因序列都有氨基酸的替代突變，筆者推測(cè)，這種類型的突變可能導(dǎo)致OprD 孔蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。另外，有2 株菌株（P3、P9）因突變使得終止密碼子（TGA）的提前出現(xiàn)。有研究[9]顯示：在OprD基因中過早出現(xiàn)終止密碼子可以抑制OprD 孔蛋白的存在，導(dǎo)致產(chǎn)生的OprD肽鏈異常縮短，OprD 孔蛋白功能喪失。大量研究表明這也是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類（主要是亞胺培南）耐藥的重要原因。

綜上所述，OprD基因在Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中起著重要作用；OprD基因的替換、缺失或插入突變等變化可改變OprD 孔蛋白的構(gòu)象或抑制其存在，并產(chǎn)生對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)在Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中，OprD基因存在不同類型的突變，其中466～830 位點(diǎn)大片段缺失以及3 個(gè)氨基酸（S57E S59R V127L）的替代這兩種同時(shí)出現(xiàn)的突變類型是有較大價(jià)值的，由于本次研究的菌株數(shù)量少，尚需進(jìn)一步以大數(shù)量樣本研究予以驗(yàn)證以及開展深入的耐藥機(jī)制研究。此外，關(guān)于該特殊耐藥表型的銅綠假單胞菌方面的研究較少，本研究結(jié)果可為此類型的研究提供參考。