Pin1 通過調(diào)控脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶影響宮頸癌細(xì)胞的增殖及凋亡

海 燕，美力班·吐爾遜，阿仙姑·哈斯木

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 836001）

宮頸癌作為第四大全球女性常見癌癥，約占所有每年因癌癥死亡女性人數(shù)的8%[1]。宮頸癌晚期患者主要的死亡原因是由于腫瘤細(xì)胞生長速度過快及難以控制的遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。而過度的細(xì)胞增殖及凋亡水平不平衡化在腫瘤萌發(fā)過程中發(fā)揮著中流砥柱的作用[3]。據(jù)報道，在腫瘤的惡性增殖過程中，血管生成不足，腫瘤微環(huán)境具有缺氧、酸性、營養(yǎng)貧乏的特點(diǎn)，因此，腫瘤細(xì)胞必須調(diào)整能量代謝以應(yīng)對這種不利的微環(huán)境，并維持腫瘤細(xì)胞的快速生長和增殖[4]。其中，腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的改變在惡性程度較高的腫瘤中尤為活躍[5]。既往研究表明，非癌性宮頸組織、浸潤前發(fā)育不良的宮頸上皮和浸潤性宮頸癌中的脂滴逐漸增加[6]。

Pin1 是肽基脯氨酰異構(gòu)酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase）家族的成員，在許多癌癥中過表達(dá)，其通過破壞原癌基因和腫瘤抑制因子之間的平衡來促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并激活許多癌癥驅(qū)動途徑促進(jìn)腫瘤的惡性增殖[7]。據(jù)報道，Pin1 是脂質(zhì)親電體修飾的靶標(biāo)[8]，被視為治療血脂異常及相關(guān)疾病的靶點(diǎn)[9]。乙酰輔酶A 羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）可通過催化乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，被脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）所利用進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪酸從頭合成，從而滿足腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，在腫瘤的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)過程中至關(guān)重要[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Pin1 能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪含量[11]。然而Pin1 在宮頸癌脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)制并未明確，Pin1 是否通過參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡尚待研究。本實(shí)驗(yàn)以宮頸癌SiHa 細(xì)胞為研究對象，建立了shPin1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，檢測Pinl 和 ACC1，F(xiàn)ASN 蛋白表達(dá)水平，并分析Pin1 對宮頸癌細(xì)胞惡性增殖及凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞系購買于普諾賽公司；慢病毒由吉凱公司構(gòu)建；DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素及胰酶（Hyclon）；胎牛血清（Gibico）；ACC1、FASN、Caspase-8、BCL-2、GAPDH 抗體（Abcam）；C-myc 抗體（ZENBIO）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理慢病毒轉(zhuǎn)染前將一定數(shù)量細(xì)胞接種于六孔板中，按照吉凱公司提供的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組為對照組（sh-NON）、敲低組1（shPin1-1）和敲低組2（shPin1-2）。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長至一定密度時，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，參照試劑盒提供的說明書對得到的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過實(shí)時熒光定量PCR 法檢測分析各基因表達(dá)水平，β-actin 為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物序列，見表1。

表1 qRT-PCR 檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR detection genes

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)待細(xì)胞狀態(tài)良好且生長至一定密度時，提取細(xì)胞總蛋白，將得到的樣品進(jìn)行免疫印跡檢測，ECL 顯色法于凝膠成像系統(tǒng)上顯影拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)6 孔板中接種1 000 個細(xì)胞，隔天換液，培養(yǎng)12d，觀察細(xì)胞生長情況，固定、染色并采圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)將SiHa 細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8工作液，酶標(biāo)儀OD450，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)收集細(xì)胞沉淀，PBS 洗3 次，每孔加入500 μL 1×Binding Buffer 工作液和5 μL AnnexinV-PE、5 μL AnnexinV-7AAD，混勻后上機(jī)檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 GEPIA.2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）用于分析ACC1、FASN 在宮頸癌及非腫瘤組織中的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

GraphPad Prism 8.0 軟件用于統(tǒng)計分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，采用單因素方差分析方法分析各組間數(shù)據(jù)，當(dāng)P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pin1 在宮頸癌中的表達(dá)

Western Blot 檢測Pin1 蛋白在Hela、SiHa、H8 細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示Pin1 蛋白在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，且在SiHa 細(xì)胞中表達(dá)水平最高（P＜0.05），見圖1，故選取SiHa 細(xì)胞進(jìn)行Pin1 低表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染。

圖1 Pin1 蛋白在宮頸癌及正常宮頸上皮的表達(dá)情況Fig.1 The Expression of Pin1 protein in cervical cancer and normal cervical epithelium

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率的測定

Western Blot 實(shí)驗(yàn)和實(shí)時熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)檢測shPin1-NON 組、shPin1-1 組和shPin1-2 組細(xì)胞中Pin1 蛋白和mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示shPin1-1 組和shPin1-2 組Pin1 蛋白和mRNA表達(dá)均顯著低于shPin1-NON 組。結(jié)果提示Pin1表達(dá)水平被有效下調(diào)（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 檢測Pin1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Detection of Pin1 lentiviral transfection efficiency

2.3 Pin1 對宮頸癌脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的影響

通過GEPIA2 分析了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的宮頸癌和正常宮頸組織RNA 測序數(shù)據(jù)中ACC1、FASN mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯示，宮頸癌中ACC1、FASN mRNA 表達(dá)水平高于非腫瘤宮頸組織（P＜0.05），見圖3A。且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中 Pinl 與ACC1 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)[10]。qRT-PCR 和Western Blot 檢測shPin1-NON 組、shPin1-1 組和 shPin1-2 組中 ACC1、FASN mRNA 和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示shPin1-1 組和shPin1-2 組ACC1、FASN mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著低于shPin1-NON 組（P＜ 0.05），見圖3B、圖3C、圖3D。以上結(jié)果提示，協(xié)調(diào)Pin1 的表達(dá)可有效降低宮頸癌細(xì)胞中脂質(zhì)合成原料的含量，從而抑制脂肪酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。

圖3 shPin1 對宮頸癌SiHa 細(xì)胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的影響Fig.3 The effect of shPin1 on key enzymes in lipid metabolism in SiHa cells of cervical cancer

2.4 Pin1 對SiHa 細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)蛋白的影響

Western Blot 結(jié)果顯示，BCL-2、C-myc 蛋白表達(dá)隨著Pin1 的下調(diào)被抑制而Caspase-8 蛋白表達(dá)則被上調(diào)，見圖4A、圖4B；CCK-8 及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，集落形成能力，見圖4C 及細(xì)胞增殖能力，見圖4D，均隨著Pin1 的下調(diào)而降低，而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞總凋亡率呈現(xiàn)上升趨勢，見圖4E。以上結(jié)果提示，下調(diào)Pin1可有效抑制細(xì)胞增殖能力并上調(diào)細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。

圖4 下調(diào)Pin1 后宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖和凋亡情況Fig.4 Proliferation and apoptosis of SiHa cells in cervical cancer after downregulation of Pin1

3 討論

目前，測試并應(yīng)用了各種分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫組織化學(xué)研究宮頸癌發(fā)生機(jī)制的方法，靶向抗腫瘤藥物以及診斷、預(yù)后和預(yù)測生物標(biāo)志物尚處探索階段。宮頸癌發(fā)病機(jī)制的許多問題尚未得到充分研究，許多表征宮頸癌發(fā)生各個階段的生物標(biāo)志物的作用仍不清楚[12]。

Pin 基因位于染色體19p13.2 上，由N 端蛋白質(zhì)結(jié)合WW 域和C 端 PPIase 域組成編碼Pin1 異構(gòu)酶，可使pSer/Thr-Pro 基序中的脯氨酰鍵異構(gòu)化。Pin1 最初被證實(shí)為參與細(xì)胞周期進(jìn)程，但越來越多的證據(jù)表明Pin 介導(dǎo)的脯氨酰異構(gòu)化在多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用[13]。本研究檢測了2 種宮頸癌細(xì)胞系（Hela、Siha）和正常宮頸上皮細(xì)胞系中Pin1 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pin1 在Hela、Siha 細(xì)胞中均呈高表達(dá)，提示Pin1 可能與宮頸癌的進(jìn)展相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及凋亡抑制是腫瘤不良預(yù)后的始動因素。據(jù)報道，Pin1 可通過破壞促凋亡和抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及增殖促進(jìn)因子和增殖抑制因子的平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和對細(xì)胞死亡的抵抗，并實(shí)現(xiàn)復(fù)制永生化[14]。在胃癌細(xì)胞中，Pin1 可以通過靶向BRD4 以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Pin1 后，宮頸癌Siha 細(xì)胞的增殖能力明顯被抑制，凋亡水平顯著上升；Pin1 的表達(dá)水平與增殖相關(guān)蛋白c-myc 及抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 正相關(guān)，而與促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8 負(fù)相關(guān)，揭示了Pin1 對宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡的重要影響。脂質(zhì)代謝失調(diào)是癌癥中最突出的代謝改變之一。癌細(xì)胞利用脂質(zhì)代謝來獲取能量、生物膜成分和增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對腫瘤微環(huán)境影響和癌癥治療的反應(yīng)所需的信號分子[16]。據(jù)報道，脂質(zhì)代謝的紊亂會干擾腫瘤細(xì)胞的致癌途徑，并通過分泌相關(guān)代謝因子干擾正常細(xì)胞群[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中，沉默Pin1 可下調(diào)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶ACC1、FASN 的表達(dá)，提示Pin1 可能通過影響脂質(zhì)代謝途徑影響宮頸癌細(xì)胞的增殖及凋亡。后續(xù)我們將進(jìn)一步研究Pin1對脂質(zhì)代謝途徑中脂質(zhì)合成原料的生成及脂肪酸攝取能力的影響等方面分析Pin1 對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制，為宮頸癌的靶向攻克治療提供一定的理論基礎(chǔ)。