冬凌草甲素對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡作用及其分子機(jī)制研究

趙 凡，鐘尊合，王錦銳，張行軍，詹江濤，陳綿川，車憲平

膀胱癌（bladder cancer, BC）是全球常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率居癌癥譜第十位，2022年中國(guó)新發(fā)膀胱癌病例91 800例，死亡42 900例，男性的發(fā)病率遠(yuǎn)大于女性[1]。當(dāng)前，手術(shù)、化療和放療是膀胱癌的主要治療方法，此外還有靶向治療和免疫治療[2]。盡管當(dāng)前合理的綜合治療已經(jīng)為患者帶來(lái)不錯(cuò)的預(yù)后，但藥物治療并非對(duì)所有類型的膀胱癌都有效，且化療藥物的毒性及毒副作用也會(huì)帶給患者不可避免的痛苦。因此，臨床迫切需要有效且不良反應(yīng)少的治療方法。

冬凌草甲素是一種從中藥冬凌草中提取的天然萜類化合物，對(duì)多種腫瘤具有抗腫瘤作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)膀胱腫瘤也有顯著的抗腫瘤作用，但機(jī)制仍未闡明。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究冬凌草甲素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的抑制作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑 冬凌草甲素（99.85%）購(gòu)自上海MedChemExpress公司，溶解在1%二甲基亞砜（DMSO）溶液中。瞬時(shí)受體電位M7通道(TRPM7)、GAPDH、p-AKT、p53以及裂解的caspase-3和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌T24細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)研究所，在10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。

1.3 CCK8檢測(cè)冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后的增殖變化 將2×103個(gè)T24細(xì)胞置入96孔板中，培養(yǎng)直到細(xì)胞融合度達(dá)75%。然后，用不同濃度的冬凌草甲素(0、3、5、7、10、15、25和35 μmol/L)處理細(xì)胞。再一次孵育24 h后，將CCK8測(cè)定液（10 μL）添加到每個(gè)孔中并孵化4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的光密度(OD)值。將計(jì)算出的平均值用于構(gòu)建一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 遷移試驗(yàn) 將800 μL的完全培養(yǎng)基放入下腔室。預(yù)處理細(xì)胞（2.5×103）在含有200 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中含有0、1、2或3 μmol/L冬凌草甲素。在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，上腔室的培養(yǎng)基被丟棄，細(xì)胞用4%的甲醛固定，100%甲醇滲透，并用水晶紫染色。然后，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行量化。

1.5 集落形成試驗(yàn) 細(xì)胞懸浮于12孔板中生長(zhǎng)（0.5×103/孔）。在細(xì)胞穩(wěn)定地貼壁后，棄置培養(yǎng)基，將細(xì)胞在含有0、1、2、3 μmol/L冬凌草甲素的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2周。獲得圖像后記錄≥50細(xì)胞的可見(jiàn)菌落的數(shù)量。

1.6 凋亡分析 T24細(xì)胞（3×103個(gè)細(xì)胞/孔）在6孔板中生長(zhǎng)一夜，然后在37 ℃下孵化48 h，并含有0、1、2或3 μmol/L的冬凌草甲素。共有2×103個(gè)細(xì)胞被胰蛋白酶分散，并用2 μL annexin V和2 μL PI孵化。在黑暗中染色15 min后，用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，并確定凋亡細(xì)胞百分比。

1.7 Western blotting檢測(cè) TRPM7、GAPDH、p-AKT、p53和裂解caspase-3抗體蛋白表達(dá) 將20 μg蛋白質(zhì)裝載在10%的SDS-PAGE凝膠上，在80 V的恒定電壓下電泳，并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用脫脂牛奶（5%）來(lái)防止膜上的非特異性結(jié)合。隨后，用一抗和二抗孵育細(xì)胞膜?；瘜W(xué)發(fā)光法顯示條帶，用熒光鏡成像儀掃描，然后用Image J進(jìn)行量化。本研究使用的主要抗體是兔抗TRPM7、GAPDH、p-AKT、p53和裂解caspase-3抗體。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制T24細(xì)胞增殖、遷移和集落形成 不同濃度的冬凌草甲素作用T24細(xì)胞24 h后，T24細(xì)胞的增殖率顯著減弱。當(dāng)用10 μmol/L或35 μmol/L冬凌草甲素作用T24細(xì)胞時(shí)，其增殖能力分別減至62.70%和0.99%（圖1）。Transwell遷移試驗(yàn)顯示，冬凌草甲素干預(yù)24 h后，遷移的細(xì)胞數(shù)量以劑量依賴性的方式減少（圖2）；T24細(xì)胞的菌落形成率也顯著下降（圖3）。

圖1 不同濃度冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后的增殖變化

圖2 不同濃度冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后的遷移能力變化

圖3 不同濃度冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后的菌落形成能力變化

2.2 冬凌草甲素誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡 冬凌草甲素呈濃度依賴性地觸發(fā)T24細(xì)胞凋亡。冬凌草甲素處理T24細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組的p53、裂解的caspase-3蛋白水平均高于對(duì)照組，且其表達(dá)水平變化呈濃度依賴性增加（圖4）。

圖4 不同濃度冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后凋亡變化情況

2.3 冬凌草甲素通過(guò)抑制TRPM7表達(dá)滅活A(yù)KT信號(hào)通路 在冬凌草甲素處理膀胱腫瘤T24細(xì)胞后，Western blotting顯示TRPM7、p-AKT的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，且隨著冬凌草甲素的濃度增加，TRPM7、p-AKT的表達(dá)水平逐漸降低，見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度冬凌草甲素作用T24細(xì)胞后相關(guān)蛋白變化

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，非肌肉侵襲性膀胱癌（non muscle invasive bladder cancer，NMIBC）是膀胱癌的常見(jiàn)亞型之一，占臨床診斷病例的75%[4]。雖然NMIBC致死率很低，但其復(fù)發(fā)率高于其他類型的膀胱癌[5]。NMIBC治療的首選方法是手術(shù)切除[6]。目前，在內(nèi)鏡下切除術(shù)后膀胱灌注化療或基于卡介苗灌注的治療是為了消除殘留的微腫瘤，并降低腫瘤復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。然而，目前在膀胱癌進(jìn)行化療或基于卡介苗灌注治療的方法尚未被證明是普遍有效的，并且30%～45%的NMIBC患者對(duì)治療無(wú)反應(yīng)[9]。此外，隨之不可避免的出現(xiàn)局部或全局性并發(fā)癥[10]。因此，迫切需要更有效的治療方法來(lái)克服膀胱癌治療的瓶頸。

瞬時(shí)受體電位（TRP）通道是細(xì)胞膜上的陽(yáng)離子選擇性離子通道，是各種功能感受器，感受各種外界刺激，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[11]。TRPM7是一個(gè)TRP通道，包含離子通道和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并在功能上控制Mg2+和Ca2+穩(wěn)態(tài)[12]。在包括膀胱癌在內(nèi)的各種癌癥中，可見(jiàn)TRPM7的異常表達(dá)[13-14]。這些通道蛋白酶或通道激酶在腫瘤轉(zhuǎn)化期間有助于EMTC（上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化）激活，促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)和入侵，并正向促進(jìn)細(xì)胞生存[15-17]。此外，TRPM7的表達(dá)與癌癥預(yù)后不佳相關(guān)的多種臨床病理因素呈正相關(guān)[18-19]；因此，TRPM7可能成為腫瘤的可行治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物。

尤其是沉默TRPM7可以增強(qiáng)對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，增加凋亡誘導(dǎo)劑BAX/BCL2的比例，并有助于裂解的caspase-3的積累[20]。TRPM7還可以通過(guò)激活ERK1/2來(lái)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲[21]，操控致癌AKT事件，促進(jìn)各種癌癥的腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。因此，靶向抑制TRPM7表達(dá)，可以通過(guò)下調(diào)ERK或AKT阻止膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。

目前，多種藥理化合物和植物制劑已被證明可以有效減弱腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而通過(guò)阻斷TRPM7通道防止惡性腫瘤的發(fā)生[22]。waixenicin A是一種從紅珊瑚中提取的天然萜類化合物，是一種TRPM7的有效抑制劑和強(qiáng)效的抗腫瘤劑[23]。冬凌草甲素是從冬凌草中分離出來(lái)的與waixenicin A結(jié)構(gòu)類似的化合物，通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)典的致癌事件，對(duì)多種腫瘤具有顯著的抗腫瘤能力[24-25]，影響細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、遷移、入侵、凋亡和自噬，從而對(duì)癌癥的致瘤特性發(fā)揮抗腫瘤作用[26-27]。然而，到目前為止，它對(duì)膀胱癌的影響尚未見(jiàn)報(bào)告。

本研究假設(shè)抑制TRPM7可以通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)冬凌草甲素的抗腫瘤活性，并采用試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)。

盡管規(guī)范的膀胱癌治療已經(jīng)為膀胱癌患者帶來(lái)了較好的預(yù)后，但術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是膀胱癌治療的主要挑戰(zhàn)[28]。本研究探討冬凌草甲素在膀胱腫瘤中的抗腫瘤活性，并探討了其潛在機(jī)制。結(jié)果表明，冬凌草甲素通過(guò)降低TRPM7表達(dá)水平，顯著抑制T24細(xì)胞增殖、菌落形成和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究表明，冬凌草甲素可以有效阻礙各種腫瘤的生長(zhǎng)[29]。但以往的研究并沒(méi)有關(guān)注冬凌草甲素對(duì)膀胱癌的影響。本實(shí)驗(yàn)研究冬凌草甲素在膀胱癌細(xì)胞系T24中的抗增殖活性，結(jié)果顯示冬凌草甲素可以顯著抑制T24細(xì)胞系的增殖能力。冬凌草甲素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了冬凌草甲素干預(yù)后T24細(xì)胞的凋亡率。冬凌草甲素干預(yù)的T24細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的凋亡，在濃度高達(dá)1 μmol/L時(shí)，T24細(xì)胞凋亡率增加到（68.62±2.31）%。p53是一種成熟的凋亡誘導(dǎo)劑，其激活可以增加原凋亡因子的表達(dá)，減少抗凋亡基因的表達(dá)[30]。裂解caspase-3蛋白上調(diào)在細(xì)胞內(nèi)蛋白裂解和形態(tài)學(xué)特征改變中具有關(guān)鍵作用。本研究采用Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，p53和裂解caspase-3的表達(dá)水平隨著冬凌草甲素濃度的增加而增加,表明冬凌草甲素會(huì)觸發(fā)T24 膀胱癌細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明，冬凌草甲素對(duì)T24細(xì)胞具有抗增殖作用，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。冬凌草甲素限制了裸小鼠T24腫瘤生長(zhǎng)的事實(shí)證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。

TRPM7與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，例如持續(xù)慢性增殖、腫瘤抑制逃逸以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的變化[31-33]。TRPM7在各種腫瘤中處于持續(xù)活化狀態(tài)，包括膀胱癌[34]。此外，TRPM7表達(dá)的上調(diào)預(yù)示著腫瘤的生物學(xué)行為預(yù)后較差[34]。TRPM7沉默可能會(huì)限制膀胱癌的增殖、侵入和遷移能力。

waixenicin A是一種天然萜類化合物，是TRPM7的有效抑制劑，并對(duì)人類胃和乳腺腫瘤細(xì)胞的惡性行為具有不利影響[31]。據(jù)報(bào)道，冬凌草甲素是一種萜類化合物，與waixenicin A具有相似的功能結(jié)構(gòu)[35]。因此，研究冬凌草甲素對(duì)T24細(xì)胞的作用后發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能有效地降低TRPM7的表達(dá)水平，這與膀胱癌的抗凋亡、增殖、粘合和侵入潛力有關(guān)。之前的研究表明，TRPM7的抑制會(huì)使AKT信號(hào)事件失活，從而影響各種腫瘤癌細(xì)胞的命運(yùn)[16,22]。此外，報(bào)告顯示，冬凌草甲素通過(guò)滅活肺腫瘤中的AKT信號(hào)事件來(lái)減少轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性表型[36]。因此，本研究進(jìn)一步測(cè)量了AKT的磷酸化水平，以闡明冬凌草甲素的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。用冬凌草甲素治療后，T24細(xì)胞磷酸化AKT水平降低。上述發(fā)現(xiàn)表明，冬凌草甲素可能通過(guò)調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路降低TRPM7的表達(dá)，從而抑制T24細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。

綜上所述，冬凌草甲素通過(guò)抑制TRMP7、失活A(yù)KT實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。冬凌草甲素可能成為膀胱癌診療的新方法。