黃芪甲苷預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注所致肺損傷的影響及其機(jī)制

王 蕾，楊 濤，李 曼，龐申月，魯富泰，耿立成

腸缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）是腹部大手術(shù)患者圍手術(shù)期的嚴(yán)重并發(fā)癥，能夠進(jìn)展為腸源性膿毒癥甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[1]。腸I/R除影響腸組織本身之外，還能夠造成遠(yuǎn)端器官的功能障礙，其中以肺臟受累最為常見[2]。本課題組前期研究證實(shí)，黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ）灌胃預(yù)處理對腸I/R所致的腸損傷具有明確的保護(hù)作用，然而AS-Ⅳ對I/R所致肺損傷的作用仍不清楚[3]。本研究擬通過建立大鼠腸I/R模型，探討AS-Ⅳ對腸I/R所致肺損傷的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SPF級、體質(zhì)量180～220 g的SD大鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要藥物與試劑 AS-Ⅳ購自上海源葉生物科技有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18的ELISA試劑盒購自武漢Elabscience公司。兔抗NLRP3單克隆抗體、兔抗ASC單克隆抗體、兔抗caspase-1單克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體均購自上海Arigo公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 正置光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；高速低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；SDSPAGE凝膠電泳系統(tǒng)及全自動(dòng)凝膠成像-分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1. 2 方法

1.2.1 分組與給藥 將45只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)（sham）組、腸缺血再灌注（I/R）組、AS-Ⅳ預(yù)處理（AS-Ⅳ）組，每組15只。AS-Ⅳ組于造模前60 min，使用AS-Ⅳ 60 mg/kg灌胃預(yù)處理；sham組和I/R組給予等體積的生理鹽水灌胃預(yù)處理。

1.2.2 模型制備 本研究已通過天津市人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號：2021-SYDWLL-000190），并嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則進(jìn)行。大鼠于術(shù)前禁食12 h，自由飲水，參照文獻(xiàn)[4]制備腸I/R模型。采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）行腹腔注射，待麻醉滿意后仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。按照無菌操作原則，經(jīng)腹正中切口，尋找并分離腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery, SMA），無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉SMA，待SMA搏動(dòng)消失且腸壁色澤變蒼白時(shí)，開始腸缺血計(jì)時(shí)；缺血60 min后恢復(fù)SMA血流灌注，SMA搏動(dòng)恢復(fù)且小腸組織顏色由暗紅變?yōu)轷r紅，表明再灌注成功。回納血管，關(guān)閉腹腔。I/R組和AS-Ⅳ組依照上述方法建立模型，sham組僅分離SMA而不夾閉。各組均于再灌注120 min時(shí)，取肺組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.2.3 肺組織染色及病理學(xué)評分 每組取3只大鼠，取其肺組織，用10%多聚甲醛固定24 h。經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下（×100）觀察肺組織病理學(xué)改變水平并進(jìn)行病理學(xué)損傷評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 肺組織濕/干（W/D）比值的測定 每組取3只大鼠，取其左肺上葉，濾紙吸干表面液體，電子天平精確稱量肺組織的濕質(zhì)量；隨后將肺組織置于烘箱中80 ℃條件下鼓風(fēng)干燥48 h，精準(zhǔn)稱量肺組織的干質(zhì)量。肺組織W/D比值=肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量。

1.2.5 酶標(biāo)儀檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）/血清分子量為4 kDa的FITC標(biāo)記右旋糖酐（FITC-dextran 4 kDa, FD4）比值 每組取3只大鼠，經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg的FD4。10 min后于心尖部穿刺取血，行氣管切開并氣管插管，使用1 mL注射器向氣管內(nèi)緩慢注射PBS溶液充分沖洗3次，每次0.8 mL，回收得BALF。利用酶標(biāo)儀分別檢測血清和BALF中的FD4濃度，并計(jì)算BALF/血清FD4濃度的比值。

1.2.6 ELISA法檢測肺組織IL-1β和IL-18水平每組取3只大鼠，取適量肺組織，冰上充分勻漿，4℃靜置30 min后離心10 min（4×103r/min，離心半徑10 cm），收集上清。利用酶標(biāo)儀采用ELISA法檢測上清液中IL-1β和IL-18濃度水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.7 Western blotting法測定大鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá) 每組取3只大鼠，取適量肺組織，冰上充分勻漿裂解，4 ℃離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。各組蛋白樣品分別加入10%濃度的SDS-PAGE凝膠泳道中電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入以下一抗：兔抗NLRP3單克隆抗體（稀釋比1∶500）、兔抗ASC單克隆抗體（稀釋比1∶1 000）、兔抗caspase-1單克隆抗體（稀釋比1∶500）和兔抗GAPDH單克隆抗體（稀釋比1∶2 000），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育2 h。洗滌PVDF膜，于暗室加入ECL發(fā)光液，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行陽性信號檢測，并用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值的比值，即為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-Ⅳ對肺組織病理學(xué)的影響 與sham組比較，I/R組中的肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔發(fā)生塌陷、融合，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血，肺泡腔和肺間質(zhì)存在大量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織病理學(xué)損傷評分顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-Ⅳ組中的肺泡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)破壞減少，水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，肺組織病理學(xué)損傷評分顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 三組肺組織病理學(xué)變化情況比較 （HE染色，×100）

表1 三組大鼠肺組織病理性損傷評分、W/D比值和BALF/血清FD4比值的比較

2.2 AS-Ⅳ對肺組織W/D比值和BALF/血清FD4比值的影響 與sham組比較，I/R組肺組織W/D比值和BALF/血清FD4比值顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-Ⅳ組肺組織W/D比值和BALF/血清FD4比值顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 AS-Ⅳ對大鼠肺組織IL-1β和IL-18含量的影響 與sham組比較，I/R組IL-1β和IL-18含量顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-Ⅳ組IL-1β和IL-18含量顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 三組大鼠肺組織IL-1β和IL-18含量的比較

2.4 AS-Ⅳ對肺組織NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)的影響 與sham組比較，I/R組NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-Ⅳ組NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 Western blotting法測定大鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)情況

表3 三組大鼠肺組織NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

急性肺損傷是腸I/R最易并發(fā)的遠(yuǎn)隔臟器損傷，也是腸I/R損傷引發(fā)MODS的重要環(huán)節(jié)，探討腸I/R所致肺損傷的治療手段十分必要[6]。本研究通過建立腸I/R的大鼠模型，研究AS-Ⅳ對腸I/R所致肺損傷的影響及其分子機(jī)制。

黃芪作為珍貴的傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國沿用已有千年之久。中國藥典記載，藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪或者膜莢黃芪的干燥根，AS-Ⅳ是黃芪最主要的活性單體成分，其化學(xué)本質(zhì)是一種四環(huán)三萜類皂苷[7]。近期研究證實(shí)，AS-Ⅳ對多種因素導(dǎo)致的肺損傷具有一定的治療作用[8-10]。因此，本研究參照前期實(shí)驗(yàn)條件，用60 mg/kg的AS-Ⅳ對大鼠進(jìn)行灌胃預(yù)處理，觀察AS-Ⅳ對腸I/R所致肺損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸I/R模型組的肺組織病理學(xué)損傷評分、肺組織W/D比值和BALF/血清FD4比值均顯著升高，表明大鼠腸I/R能夠誘發(fā)肺組織損傷，證實(shí)動(dòng)物模型構(gòu)建成功；AS-Ⅳ能夠顯著降低肺組織病理學(xué)損傷評分、肺組織W/D比值和BALF/血清FD4比值，表明AS-Ⅳ對腸I/R所致的肺損傷具有明確的保護(hù)作用，能夠減輕急性肺損傷的嚴(yán)重程度。

促炎細(xì)胞因子過度釋放能夠啟動(dòng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)炎性免疫細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致?lián)p傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮誘發(fā)肺水腫，最終發(fā)生急性肺損傷，因此炎性介質(zhì)過度釋放被認(rèn)為是肺組織損傷的重要發(fā)病機(jī)制[11]。有研究表明，腸I/R引發(fā)的肺損傷能夠通過激活免疫細(xì)胞釋放更多的IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子，從而進(jìn)一步加重肺臟及全身炎癥反應(yīng)[12]。本研究進(jìn)一步探討AS-Ⅳ對腸I/R相關(guān)肺損傷的炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，腸I/R模型的肺組織中IL-1β和IL-18的含量顯著升高，AS-Ⅳ則能顯著降低炎性因子IL-1β和IL-18在肺組織中的含量，提示AS-Ⅳ對腸I/R所致肺損傷的改善作用可能與其顯著的抗炎作用有關(guān)。

NLRP3炎癥小體在機(jī)體的炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制中扮演著核心角色[13]。在I/R等傷害性信號的刺激下，損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）能夠被多種模式識(shí)別受體所識(shí)別，其中的胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體NLRP3通過與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC相互銜接，進(jìn)而募集pro-caspase-1形成巨大的蛋白復(fù)合體，即為NLRP3炎癥小體，促使pro-caspase-1自我切割成熟為caspase-1，活化的caspase-1一方面切割消皮素（Gasdermin D, GSDMD）形成GSDMD-NT，后者與細(xì)胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合，導(dǎo)致質(zhì)膜孔的形成，誘發(fā)細(xì)胞焦亡；另一方面，caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18形成具有活性的IL-1β和IL-18，并隨細(xì)胞焦亡的發(fā)生釋放至胞外，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[14]。本研究在發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ對腸I/R相關(guān)肺損傷的改善作用與減少IL-1β和IL-18含量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討NLRP3炎癥小體在AS-Ⅳ治療腸I/R相關(guān)肺損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在I/R模型的肺組織中，NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明NLRP3炎癥小體參與肺損傷的發(fā)生與進(jìn)展過程；而AS-Ⅳ能夠顯著下調(diào)肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1的高表達(dá)水平，提示AS-Ⅳ可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活來發(fā)揮對腸I/R所致肺損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，AS-Ⅳ灌胃預(yù)處理能夠顯著改善大鼠腸I/R所致的肺損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)NLRP3炎癥小體活化水平，減少IL-1β、IL-18等炎性因子釋放，進(jìn)而減輕肺部組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。