蘋(píng)果果實(shí)褐腐病病原菌分離鑒定

呂昭龍，蔣晶晶，李繼平,3，翟艷青，惠娜娜，王 立，馬生彪，鄭 果,3，漆永紅，王森山

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部天水作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，甘肅天水 741299)

蘋(píng)果屬于薔薇科(Rosaceae)蘋(píng)果屬(Malusspp.)，是中國(guó)主要的栽培水果之一。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織的數(shù)據(jù)，2018年中國(guó)蘋(píng)果種植面積達(dá)到207萬(wàn)hm2[1]。但近年來(lái)，由于蘋(píng)果褐腐病的發(fā)生危害，嚴(yán)重影響了果實(shí)品質(zhì)和出口效益，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，褐腐病在核果類(lèi)和仁果類(lèi)果實(shí)上常有發(fā)生，由鏈核盤(pán)屬真菌(Moniliniaspp.)感染引起，主要危害植物的花、芽、枝和果實(shí)，尤其是接近成熟期、收獲期和貯藏期的果實(shí)[3]。褐腐病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，其中澳大利亞、亞洲、美洲和歐洲危害最大[4-6]。中國(guó)已有16個(gè)省有褐腐病的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，引起蘋(píng)果褐腐病的病原菌是Moniliniaspp真菌中親緣關(guān)系最密切的6個(gè)種，即：果生鏈核盤(pán)菌(Moniliniafructicola)[7]，核果鏈核盤(pán)菌(M.laxa)，產(chǎn)核鏈核盤(pán)菌(M.fructigena)，梅生鏈核盤(pán)菌(M.mumecola)[8]，云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)和聚子座鏈核盤(pán)菌(M.polystroma)。靜寧縣地處北緯35°的黃土高原暖溫帶半濕潤(rùn)氣候區(qū)，土層深厚，光熱資源豐富，年均溫度、降雨量、日照時(shí)數(shù)等氣候條件非常適宜蘋(píng)果生長(zhǎng)，是世界公認(rèn)的蘋(píng)果“黃金生產(chǎn)帶”，蘋(píng)果種植面積超過(guò)6.66萬(wàn)hm2，是甘肅蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)之一，“靜寧蘋(píng)果”是甘味食品的重要品牌，憑借優(yōu)質(zhì)品質(zhì)與品牌效應(yīng)，靜寧蘋(píng)果暢銷(xiāo)全國(guó)，甚至遠(yuǎn)渡重洋出口國(guó)外。

蘋(píng)果褐腐病的發(fā)生為害，不僅造成果實(shí)腐爛，果農(nóng)受損，甚至還會(huì)影響到市場(chǎng)銷(xiāo)售及其品牌[9]。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于蘋(píng)果褐腐病病原菌種類(lèi)的報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)甘肅省靜寧縣蘋(píng)果果實(shí)褐腐病病原菌的鑒定，明確病原菌種類(lèi)，為蘋(píng)果褐腐病防治和當(dāng)?shù)靥O(píng)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年10月于甘肅省靜寧縣采集發(fā)病的‘秦冠’蘋(píng)果果實(shí)褐腐病樣品，裝入自封袋中于4 ℃冰箱內(nèi)保存。選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)用于病菌的分離純化和 培養(yǎng)。

1.2 蘋(píng)果褐腐病發(fā)病部位菌株的分離

采用組織分離法分離蘋(píng)果褐腐病發(fā)病部位的菌株。先將樣品用無(wú)菌蒸餾水沖洗并晾干。使用滅菌的解剖刀在蘋(píng)果果皮病健交界處切下 4 mm×4 mm的組織塊。將組織塊浸入5% NaClO中 90 s，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次。再將其放入75%乙醇中40 s進(jìn)行消毒，然后用滅菌蒸餾水沖洗3次。用滅菌鑷子將消毒后的組織塊放置在無(wú)菌濾紙上，晾干后放在PDA上，25 ℃避光培養(yǎng)3 d后，挑取單個(gè)菌落的菌絲，轉(zhuǎn)移到新的PDA上，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，備用。

1.3 蘋(píng)果褐腐病發(fā)病部位分離菌株形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后觀察待測(cè)純化菌株的菌落特征，包括菌落正面和反面的顏色，氣生菌絲的情況，菌落邊緣的形狀，菌落的質(zhì)地等，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并 記錄。

顯微形態(tài)：將待測(cè)純化菌株在PDA平板上培養(yǎng)產(chǎn)孢，對(duì)于不產(chǎn)孢的菌株，采用菌落劃傷法、液體搖培等方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢。將產(chǎn)生的分生孢子、分生孢子盤(pán)等結(jié)構(gòu)置于載玻片上，以無(wú)菌水做浮載劑，在顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)特征，對(duì)于菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行拍照和記錄描述，隨機(jī)選取30個(gè)分生孢子，測(cè)量分生孢子的大小。

1.4 蘋(píng)果褐腐病分離菌株分子生物學(xué)測(cè)定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)提取病原菌DNA，用于PCR反應(yīng)的引物信息見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含2×TaqMasterMix 12.5 μL ，正反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，以ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 用于蘋(píng)果褐腐病鑒定的引物信息Table 1 Primers used in this study

取5 μL上述 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳(U：110 V)進(jìn)行檢測(cè)后將 PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的基因序列與 GenBank 中的序列進(jìn)行比對(duì)，下載相似性高的序列及其對(duì)應(yīng)復(fù)合種的常見(jiàn)模式菌株序列，使用 MEGA7.0 軟件剪切后按照ITS-TUB2-Lcc2的順序首尾拼接，分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán) 1 000次，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 蘋(píng)果褐腐病分離菌株致病性測(cè)定

用刺傷—菌絲接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。在PDA上培養(yǎng)待測(cè)菌株5 d后，在菌落邊緣打孔 (5 mm)，待用。選擇生長(zhǎng)健康的‘富士’‘秦冠’‘新紅星’和‘嘎啦’蘋(píng)果果實(shí)作為接種材料。首先將蘋(píng)果清洗干凈，晾干，再用75%酒精消毒，然后用無(wú)菌水沖洗3次。用無(wú)菌鐵釘(5 mm)刺破蘋(píng)果表面后，將菌絲塊接入傷口處，接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照(CK)。將接種后的蘋(píng)果果實(shí)密封并保存在25 ℃的培養(yǎng)箱中。每個(gè)處理重復(fù)9次，接種后每天觀察發(fā)病情況并記錄病斑擴(kuò)展直徑(D)。結(jié)果分別確定為弱致病性(D<27.5 mm)、中度致病性(27.5 mm40 mm)。對(duì)于接種后發(fā)病的樣本，采用組織分離法再次分離病原菌，并與原分離菌進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果褐腐病分離菌株形態(tài)學(xué)鑒定

蘋(píng)果褐腐病癥狀表現(xiàn)為果實(shí)的表面會(huì)發(fā)生腐爛(圖1-A和1-B)。發(fā)病部位呈黃褐色。嚴(yán)重時(shí)呈黑色，有發(fā)酵氣味，使果實(shí)無(wú)法食用，影響果實(shí)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。從21份樣品中分離出的32份菌株均為同一類(lèi)型，命名為PGHF。菌株P(guān)GHF在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后(圖1-C和1-D)，菌落直徑為85 mm，邊緣整齊、圓形，表面蓬松，氣生菌絲的正面和背面是白色的。分離株在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30 d后(圖1-E和1-F)，氣生菌絲貼在在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌落產(chǎn)生大小和形狀不同的深褐色基質(zhì)。在顯微鏡下觀察，菌絲無(wú)色透明，有隔膜，分生孢子梗直接由菌絲發(fā)育而來(lái)。分生孢子呈珠狀，有分枝或單枝(圖1-G和1-H)。分生孢子呈黃棕色、檸檬形或紡錘形，大小為7.73 μm～10.83 μm×12.52 μm～19.97 μm(圖1-I)。根據(jù)形態(tài)特征觀察，判斷分離菌株與云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)相似。

A和B.果實(shí)褐腐病癥狀；C和D.在PDA上生長(zhǎng)7 d的菌落；E和F.在PDA上生長(zhǎng)30 d的菌落；G和H.分生孢子梗和分生孢子； I.分生孢子。標(biāo)尺表示20 μm

2.2 蘋(píng)果褐腐病分離菌分子生物學(xué)鑒定

使用真菌通用引物ITS1/ITS4、特異性引物Bt2a/Bt2b和Lcc2對(duì)分離得到的PGHF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS基因長(zhǎng)度為514 bp，TUB基因長(zhǎng)度為451 bp，Lcc2基因長(zhǎng)度為 887 bp。BALST比較結(jié)果表明，PGHF菌株的3個(gè)基因與云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)的序列匹配率最高。從NCBI下載同屬已知菌株和外群已知菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2，本研究使用的菌株加粗)。菌株P(guān)GHF和云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)(菌株號(hào)：BCB-1、AK9-1、YS1-1)以70%的支持率聚集在同一分支，親緣關(guān)系接近。序列比對(duì)結(jié)果表明，菌株P(guān)GHF和云南鏈核盤(pán)菌Moniliayunnanensis(菌株號(hào)：BCB-1、AK9-1、YS1-1)的ITS、TUB和Lcc2基因序列同一性分別為85.48%、88.57%和84.82%(P<0.05)(圖3)。分離菌株ITS基因與其他菌株的序列無(wú)差異，而TUB和Lcc2基因的序列同一性明顯高于其他菌株。隨后，利用特異性引物ClaF/ClaR、LlaF/LlaR、GplaF/PlaR、GClaF/GClaR和GplaF/GlaR對(duì)PGHF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步確認(rèn)分離物是否為云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)。結(jié)果表明，云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)的特異性引物GClaF/GClaR在電泳中顯示出一條大小為600 bp的亮帶(圖4)。結(jié)合形態(tài)特征，確定分離出的褐腐病病原菌PGHF為云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)。

圖2 基于 ITS、 TUB和 Lcc2基因的最大簡(jiǎn)約分析系統(tǒng)發(fā)育圖(隱秘刺盤(pán)孢C.aenigma為外群)Fig.2 Phylograms of Monilinia spp. and Monilia complex based on maximum-parsimony analysis with ITS, TUB and Lcc2 gene(C.aenigma are outgroups)

云南鏈核盤(pán)菌ITS基因序列同一性與核果鏈核盤(pán)菌、梅生鏈核盤(pán)菌差異顯著，與其他3種鏈核盤(pán)菌無(wú)顯著差異；云南鏈核盤(pán)菌TUB基因序列同一性與其余5種鏈核盤(pán)菌差異顯著；云南鏈核盤(pán)菌 Lcc2基因序列同一性與其余5種鏈核盤(pán)菌差異顯著。圖中不同小寫(xiě)字母表示不同鏈核盤(pán)菌間差異顯著(P<0.05)

云南鏈核盤(pán)菌Monilia yunnanensis 的特異性引物為GClaF/GClaR。PCR產(chǎn)物約600 bp

2.3 蘋(píng)果褐腐病病原菌致病性測(cè)定

分離菌株P(guān)GHF對(duì)不同品種蘋(píng)果的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株接種24 h后對(duì)蘋(píng)果無(wú)明顯致病性；菌株接種48 h后對(duì)‘秦冠’‘富士’和‘新紅星’有不同程度的致病作用(表2)。菌株接種‘富士’48 h后病斑直徑為26.28 mm，病斑擴(kuò)展率為21.28 mm/d(P<0.05)；菌株接種‘秦冠’48 h后病斑直徑為19.72 mm，病斑擴(kuò)展率為14.72 mm/d (P<0.05)；菌株接種‘新紅星’48 h后病斑直徑為15.67 mm，病斑擴(kuò)展率為10.67 mm/d(P< 0.05)?！吕病臃N分離株48 h后發(fā)病不明顯。菌株接種‘富士’72 h后表現(xiàn)有較強(qiáng)的致病性，病斑直徑為44.78 mm(圖5-B)，病斑擴(kuò)展率為18.50 mm/d(P<0.05)，明顯快于其他品種。菌株接種‘秦冠’和‘新紅星’72 h后表現(xiàn)為中度致病性，病斑直徑分別為36.39 mm(圖5-A)和30.00 mm(圖5-D)，病斑擴(kuò)展率為16.67 mm/d和14.33 mm/d(P<0.05)。菌株接種‘嘎啦’72 h后發(fā)病不明顯(圖5-C)。

表2 蘋(píng)果果實(shí)接種褐腐病病原菌的擴(kuò)展率和病斑直徑Table 2 Expansion rate and diameter of brown rot inoculated on apple fruit

左邊果實(shí)為對(duì)照，右邊果實(shí)為處理；A.秦冠；B.富士；C.嘎啦；D.紅星

3 討 論

本研究從甘肅省平?jīng)鍪徐o寧縣蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)采集的蘋(píng)果褐腐病樣品中分離出同一種類(lèi)型的真菌。結(jié)合形態(tài)特征、多基因序列分析和常規(guī)PCR方法，確定該地區(qū)蘋(píng)果褐腐病分離株為云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)，經(jīng)柯赫氏法則確定為當(dāng)?shù)靥O(píng)果褐腐病病原菌。云南鏈核盤(pán)菌是中國(guó)普遍存在的褐腐病病原菌，為2011年在云南省發(fā)現(xiàn)的新種，分布于云南大部分地區(qū)。在北京、河北、陜西、新疆、遼寧等省也有報(bào)道，對(duì)桃、杏、山楂、蘋(píng)果、梨等核果類(lèi)果實(shí)和仁果類(lèi)果實(shí)有很強(qiáng)的危害[9，12-13]。

近年來(lái)，Zhang等[14]首次在西藏油桃上分離到云南鏈核盤(pán)菌，進(jìn)一步表明云南鏈核盤(pán)菌在中國(guó)褐腐病發(fā)生地區(qū)分布廣泛。Zhu等[11]通過(guò)多基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Moniliayunnanensis、M.polystroma和Moniliniafructigena3 種親緣關(guān)系較近，而云南鏈核盤(pán)菌與其他褐腐病病原的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，病原菌在地理分布上也表現(xiàn)出差異[15-17]。本試驗(yàn)僅對(duì)甘肅省平?jīng)鍪徐o寧縣的褐腐病病原進(jìn)行了初步鑒定，采樣面積小，樣本較少。今后將針對(duì)不同地區(qū)，甚至是不同國(guó)家褐腐病分離種群的遺傳多樣性進(jìn)一步探討，同時(shí)對(duì)于不同地區(qū)的遺傳分化也有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)對(duì)不同品種蘋(píng)果的致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，云南鏈核盤(pán)菌對(duì)不同蘋(píng)果品種具有不同的致病表現(xiàn)，對(duì)‘富士’呈強(qiáng)致病性，對(duì)‘嘎啦’致病性較弱。這可能與品種的抗病性有關(guān)，其抗病機(jī)制有待進(jìn)一步探索。但本研究中用于致病性試驗(yàn)的蘋(píng)果品種較少，品種的抗病性無(wú)法進(jìn)一步闡述。后期應(yīng)選擇更多品種進(jìn)行試驗(yàn)，為抗病育種提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

綜上所述，甘肅省靜寧縣蘋(píng)果褐腐病病原菌為云南鏈核盤(pán)菌(Moniliayunnanensis)，該病原菌對(duì)不同品種蘋(píng)果的致病性具有一定差異。