一株系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)細(xì)菌D8的鑒定及其對(duì)新疆加工番茄促生防病效果初探

林 青，史應(yīng)武，王 瑋，張麗娟，黃 偉，楊紅梅，楚 敏，包慧芳，王 寧，霍向東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

新疆因得天獨(dú)厚的光熱資源優(yōu)勢(shì)，是全國(guó)最主要的加工番茄產(chǎn)區(qū)，番茄產(chǎn)量位居世界第三，被譽(yù)為新疆的“紅色產(chǎn)業(yè)”[1]。然而，隨著規(guī)?；a(chǎn)迅速發(fā)展，連作和重茬使番茄病害種類逐漸增多，主要病害近20種，病情日趨嚴(yán)重，給新疆加工番茄生產(chǎn)造成巨大損失。因病原菌及發(fā)病條件差異，病害能發(fā)生在番茄的不同生長(zhǎng)期和不同部位，并通過氣流、雨水或隨種子遠(yuǎn)距離傳播，許多病原菌能在土壤病殘組織或種子上越冬，或在干燥的種子上存活多年，有的甚至能侵染多種植物，造成在植株間反復(fù)多次侵染，使病害難以根除[2]。常規(guī)防治中，噴灑化學(xué)農(nóng)藥是最直接、快速、高效的手段，但農(nóng)藥的利用率普遍較低，不但污染環(huán)境，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，影響人類身體健康，還會(huì)因連續(xù)施用致使病原菌產(chǎn)生抗藥性[3]。研究表明，植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)不僅能通過固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)生鐵載體或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等功能，幫助植物有效利用土壤養(yǎng)分并促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還可對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間，或誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性實(shí)現(xiàn)生物防治作用[4]。誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance，ISR)是有益微生物幫助植物自我防御的重要機(jī)制，可在植物局部識(shí)別激發(fā)子時(shí)觸發(fā)，通過茉莉酸途徑使植物級(jí)聯(lián)成廣譜系統(tǒng)反應(yīng)[5]，因其無污染、廣譜性、系統(tǒng)性、非特異性、不使病原微生物產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，是作物病蟲害防治的生態(tài)友好途徑[6]。目前，各國(guó)學(xué)者已廣泛在防治植物真菌病害、細(xì)菌病害、蟲害[7]，病毒病害[8]，抑制果蔬采后病害[9]，耐鹽脅迫[10]等方面開展了微生物誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的研究，并獲得顯著效果。Paenarthrobacternitroguajacolicus(也稱Arthrobacternitroguajacolicus)是2004年報(bào)道的新種，能降解或轉(zhuǎn)化硝基芳香族化合物[11]，在工業(yè)、醫(yī)藥、污染治理等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[12]，但在植物促生防病方面的功能還在挖掘探索中。本研究探索P.nitroguajacolicus對(duì)新疆加工番茄的促生防病作用及機(jī)理，為開拓該菌株的應(yīng)用領(lǐng)域和功能及新疆加工番茄病害的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株D8：前期工作中從新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)十二師104團(tuán)2連蔬菜站(N:43°41′15.3″，E:87°27′34.7″)豆角根際土壤分離獲得，現(xiàn)保存于新疆微生物資源保藏管理中心。

PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃高壓滅菌20 min；營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化鈉5 g，(NA：瓊脂15 g)，蒸餾水1 000 mL，pH 7.3± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min。植物茉莉酸(JA)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)試劑盒：江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；SK8255Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

茄鏈格孢菌Alternariasolani、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子健康中心提供。加工番茄種子‘新番45號(hào)’(新紅48號(hào))由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌株D8的分子生物學(xué)鑒定 通過測(cè)定16S rDNA序列進(jìn)行菌株的初步鑒定。采用 SK8255Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取菌株基因組 DNA，用通用引物27F、1492R擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL。PCR產(chǎn)物由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司純化和測(cè)序，測(cè)得序列經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)分析。序列提交GenBank獲得登錄號(hào)。采用 MEGA 5 以鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值1 000。

1.2.2 菌株D8對(duì)加工番茄生長(zhǎng)的影響 菌液及菌懸液準(zhǔn)備：將D8接種于NB培養(yǎng)基，于 37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，用平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌液濃度。用無菌生理鹽水稀釋菌液至104倍數(shù)，菌液濃度為104cfu/mL，用于加工番茄種子浸種。將培養(yǎng)24 h D8菌液于9 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀菌體用清水重懸為濃度為109cfu/mL菌懸液，用于灌根處理。

對(duì)種子發(fā)芽的影響：選取飽滿、均勻一致的加工番茄種子，參照趙偉進(jìn)等[13]的方法進(jìn)行表面消毒。以無菌生理鹽水和稀釋104倍的NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將種子分別浸泡于稀釋菌液和對(duì)照中，37 ℃吸附4 h，在超凈工作臺(tái)風(fēng)干后，置于鋪有用等量無菌水濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10粒種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，3 d后調(diào)查種子發(fā)芽勢(shì)，測(cè)量根長(zhǎng)，5 d后調(diào)查種子發(fā)芽率，依據(jù)下列公式計(jì)算：

發(fā)芽勢(shì)(Germination energy) =3 d 正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù) ×100%

發(fā)芽率(Germination rate) = 5 d正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子數(shù) ×100%

對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響：用D8菌液對(duì)加工番茄種子進(jìn)行兩種處理：A用稀釋菌液(104cfu/mL)進(jìn)行浸種處理；B用菌懸液(109cfu/mL)進(jìn)行灌根處理，以清水處理為對(duì)照。對(duì)照組和灌根處理組用生理鹽水浸種，37 ℃保溫4 h。分別在裝有草炭∶蛭石=2∶1(體積比)基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，點(diǎn)播浸種后的種子，對(duì)照組和浸種組每缽澆清水100 mL，灌根組每缽添加15 mL菌懸液和85 mL清水。每個(gè)處理種10缽，重復(fù)3次。每5 d澆一次清水，每次澆100 mL/缽。待番茄長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，測(cè)量幼苗根長(zhǎng)、株高和鮮質(zhì)量。

1.2.3 菌株D8對(duì)加工番茄幼苗茉莉酸含量的影響 誘導(dǎo)接種：待番茄幼苗在草炭∶蛭石= 2∶1(體積比)基質(zhì)長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)、株高一致的幼苗，按“1.2.2”方法灌根。以清水處理為對(duì)照，每個(gè)處理10缽，重復(fù)3次。

茉莉酸含量的測(cè)定：灌根后每天采集番茄葉片，每天采集6缽，每株采集1片葉片，將葉片混合后分成3份，連續(xù)5 d，用植物茉莉酸(JA)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)試劑盒，按說明書操作，測(cè)量番茄葉片茉莉酸含量。

1.2.4 菌株D8對(duì)加工番茄的防病效果 對(duì)峙試驗(yàn)：打取茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌菌落邊緣直徑為6 mm的菌餅，置于PDA培養(yǎng)基平板中心，從新鮮的D8 NA平板挑取單菌落點(diǎn)接于距病原菌中心2 cm的四周，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d；將青枯雷爾氏菌接種于NB培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，吸取100 μL菌液涂布于NA培養(yǎng)基上，晾干后在平板背面畫十字，挑取菌株D8單菌落點(diǎn)接于距中心2 cm的4點(diǎn)處，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。觀察菌株生長(zhǎng)情況。

病原菌制備：將茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌分別接種于裝有50 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，每株菌接種10瓶，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14 d，待長(zhǎng)出孢子，用無菌水在無菌條件下洗脫孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將濃度調(diào)整為106cfu/mL的孢子懸浮液。將青枯雷爾氏菌搖瓶培養(yǎng)，用平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌液濃度為109cfu/mL。

誘導(dǎo)接種：方法同“1.2.3”。

挑戰(zhàn)接種：誘導(dǎo)處理5 d后，分別將茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌孢子懸浮液和青枯雷爾氏菌液進(jìn)行葉面噴施，接種后保濕48 h，培養(yǎng)室溫度28 ℃，濕度RH≥90%。挑戰(zhàn)接種第5天和第14天按如下方法統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)和誘抗效果。發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

病情指數(shù)=∑(病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值)/(總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值)×100%

誘抗效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%

表1 加工番茄早疫病、灰霉病和青枯病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grade standard for incidence degree of gray mold, early blight and bacterial wilt of processed tomato

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用WPS EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株D8的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

在 NCBI 網(wǎng)站對(duì)菌株D8的16S rDNA序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，利用 MEGA 5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株D8與P.nitroguajacolicusG2-1相似性高達(dá)99.15%，系統(tǒng)發(fā)育樹將2株菌聚為一類，親緣關(guān)系最近，該菌種屬于放線菌綱，微球菌科。因此初步將菌株D8鑒定為硝基癒瘡木膠節(jié)桿菌(圖1)。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株D8對(duì)加工番茄生長(zhǎng)的影響

2.2.1 菌株D8對(duì)種子萌發(fā)的影響 D8稀釋菌液浸種處理的種子，根長(zhǎng)為對(duì)照組的1.79和 1.85倍，發(fā)芽勢(shì)提高了36.85%和85.71%，發(fā)芽率提高了38.10%和52.64%。與2組對(duì)照相比，菌株D8稀釋菌液對(duì)加工番茄種子萌發(fā)有顯著 (P<0.05)促進(jìn)作用，能明顯增加種子的根長(zhǎng)，提高發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率(表2)。

表2 菌株D8對(duì)加工番茄種子萌發(fā)的促進(jìn)作用Table 2 Germination of processed tomatoseeds promoted by strain D8

2.2.2 不同處理方式下菌株D8對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照相比，浸種和灌根處理的幼苗生長(zhǎng)更加茁壯，枝葉增多，根長(zhǎng)增加，須根更多(圖2)。2種處理下幼苗的根長(zhǎng)比對(duì)照增加約3 cm，株高增加約2.5 cm。此外，浸種處理幼苗明顯增加了須根和枝葉的數(shù)量，鮮質(zhì)量是對(duì)照的2.95倍，是灌根處理的1.6倍。2種處理均能顯著(P< 0.05)促進(jìn)加工番茄幼苗生長(zhǎng)(表3)。

圖2 灌根(A)和浸種(B)處理方式下D8對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of D8 on seedling growth under root irrigation (A) and seed soaking (B) treatments

表3 不同處理方式加工番茄的生長(zhǎng)Table 3 Growth of processed tomato under different treatment methods

2.3 菌株D8對(duì)加工番茄幼苗內(nèi)源茉莉酸含量的影響

茉莉酸是植物體內(nèi)與抗病性密切相關(guān)的重要激素，與其他信號(hào)通路互作引發(fā)防御反應(yīng)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，具有系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)功能的PGPR會(huì)使植物內(nèi)源茉莉酸水平升高[14]。圖3中CK處理表明，加工番茄幼苗內(nèi)源茉莉酸含量會(huì)隨基質(zhì)水分的變化而波動(dòng)，呈現(xiàn)缺水時(shí)升高澆水后逐步降低的規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，D8菌懸液處理幼苗后前 2 d，明顯緩解了缺水造成的茉莉酸含量升高，第3天水分充足情況下，處理組誘導(dǎo)了內(nèi)源茉莉酸含量顯著(P<0.05)升高，并能維持2 d。

柱形上方不同小寫字母表示Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)在 P<0.05差異顯著

2.4 菌株D8誘導(dǎo)加工番茄系統(tǒng)抗性的防病效果

D8與3種病原菌在平板上共同生長(zhǎng)，在交匯處均無抑菌帶或抑菌圈出現(xiàn)，表明菌株D8對(duì)3種病原菌均無拮抗性(圖4)。

A.灰葡萄孢菌;B.茄鏈格孢菌;C.青枯雷爾氏菌

菌株D8可誘導(dǎo)加工番茄內(nèi)源茉莉酸水平升高，產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，分別挑戰(zhàn)接種病原菌后能顯著(P<0.05)降低早疫病、灰霉病和青枯病的病情指數(shù)，在發(fā)病早期(5 d)對(duì)早疫病、灰霉病有很好的抗性，處理組病情指數(shù)僅為對(duì)照組的16.69%和7.98%，在挑戰(zhàn)接種14 d，對(duì)3種病病原菌仍有28.77%～37.90%的誘抗效果(表4)。

表4 菌株D8對(duì)加工番茄病害的誘抗效果Table 4 Induced effects of strain D8 on processed tomato diseases

3 討 論

病害多發(fā)是影響新疆加工番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要難題之一[2]。原因主要有三：一是新疆目前栽種品種還沒有對(duì)早疫病、疫霉菌、病毒病或細(xì)菌性病害的免疫或高抗品種，甚至有些還是感病或高感品種[15]；二是連作種植改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致根際有益菌數(shù)量減少病原菌大量滋生，從而降低了加工番茄抵御病害的能力[16-17]；三是新疆為溫帶大陸性氣候，每年6-8月氣溫高、降雨量大，加工番茄的無架栽培模式郁蔽程度大，高溫高濕條件利于病原菌傳播、侵染、繁殖[18]。為此，發(fā)生病害時(shí)應(yīng)全面分析病因，采取選育抗病品種，消毒處理種子、苗床，加強(qiáng)田間管理，合理輪作，藥劑施用等多種措施進(jìn)行綜合防治[19]。與化學(xué)農(nóng)藥相比，PGPR可通過調(diào)節(jié)植物代謝、改善根際營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、降解土壤污染物等多種途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植株生活力、增強(qiáng)植物對(duì)病害或環(huán)境脅迫的抵抗能力，抑制植物病原菌生長(zhǎng)，一些多功能的PGPR可發(fā)揮促生和生物防治的雙重作用[20]，生物防治方法具有作用范圍廣譜、持效時(shí)間長(zhǎng)效、不易產(chǎn)生抗藥性及對(duì)生態(tài)環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)[21]，應(yīng)用前景廣闊。

Ludmila等[11]于2004年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了新種P.nitroguajacolicus，歸類于節(jié)桿菌屬。節(jié)桿菌屬在代謝方面能力突出，一些物種具有代謝異生物質(zhì)的能力[22]，如Paenarthrobactersp.A01可降解磺胺二甲嘧啶 (SMZ)，減少環(huán)境中磺胺類抗生素的污染[23]。P.aurescensTC1可降解除草劑莠去津[24]。節(jié)桿菌( Arthrobacter )對(duì)降解土壤中增塑劑鄰苯二甲酸二正丁酯( DBP)具有廣譜活性，可作為檢測(cè) DBP 污染的生物標(biāo)志物及生物修復(fù)接種劑[25]。以往研究中P.nitroguajacolicus在不同領(lǐng)域也展現(xiàn)了多面的功能。A.nitroguajacolicusZJUTB06-99能產(chǎn)生腈水解酶將具生物毒性的丙烯腈生物轉(zhuǎn)化為工業(yè)原料丙烯酸[26]。A.nitroguajacolicusRü61a能利用污染物喹哪啶(2-甲基喹啉)作為唯一的碳源和能源[27]。分離自韓國(guó)土壤的菌株P(guān).nitroguajacolicus18J Y14-14和18JY15-11具有紫外線抵抗力，是未記錄的抗輻射細(xì)菌[28]。伊朗金礦中分離的金屬抗性菌株A.nitroguajacolicus，細(xì)胞外產(chǎn)生了球形的金納米顆粒，平均尺寸為40 nm，可用于金納米顆粒的綠色生物合成[29]。在植物促生保護(hù)方面，菌株P(guān).nitroguajacolicus2-50能顯著增加番茄生產(chǎn)性植株數(shù)，提高水利用率[30]。A.nitroguajacolicusE46通過形成生物膜，與其他4株細(xì)菌通過互補(bǔ)作用保護(hù)其宿主免受真菌植物病原體的侵害[31]。A.nitroguajacolicusYB3具有高效溶磷活性，A.nitroguajacolicusYB4、YB5能產(chǎn)生大量 IAA，在10 ℃時(shí)，YB4也能有效溶解磷酸鹽，3株A.nitroguajacolicus菌株都有效增加了水稻品種 Swama 和 Swarna sub1的生物量和磷吸收[32]。

本研究菌株D8在低濃度菌液浸種處理下，即可顯著促進(jìn)加工番茄種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，提高幼苗鮮質(zhì)量效果優(yōu)于高濃度菌液灌根處理，在實(shí)際應(yīng)用中極大減少了生產(chǎn)和時(shí)間成本。此外，菌株D8還能誘導(dǎo)加工番茄幼苗內(nèi)源茉莉酸含量顯著上升，產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，在與3種病原菌均無拮抗作用情況下，能有效減輕加工番茄灰霉病、早疫病和青枯病病害，兼具促生防病功效，為新疆加工番茄病害防治提供了新的菌種資源和途徑，同時(shí)也拓展了菌種P.nitroguajacolicus的生物功能。