梨火疫病病原菌的分離鑒定及室內(nèi)抑菌藥劑篩選

陳曉曉，艾尼賽·賽米，粟神強(qiáng)，賈玉鳳，劉 琦，陳 晶

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗室，烏魯木齊 830052)

中國是全球栽培梨的三大起源中心之一[1]。梨在中國是僅次于蘋果、柑橘的第三大水果[2]，且隨著近年來農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的深入和加快，各地梨果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展[3]。新疆作為中國梨果產(chǎn)業(yè)的重要產(chǎn)區(qū)，2020年庫爾勒香梨種植面積約3.09萬hm2，總產(chǎn)量為40.27萬t[4]，香梨種植規(guī)模逐年擴(kuò)大[5]。庫爾勒香梨作為新疆地區(qū)特色林果樹種，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主要渠道[6]。但近年來，受檢疫性、細(xì)菌性病害梨火疫病的影響[7]，庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展被嚴(yán)重制約。該病由Erwiniaamylovora侵染所致，因侵染情況復(fù)雜[8]，傳播速度快，傳播途徑多，寄主范圍廣，故其致病菌被稱為全球十大植物病原細(xì)菌之一[9]。

在化學(xué)藥劑防治方面，國外因長時間使用農(nóng)用鏈霉素導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗藥性[10]。在中國由于農(nóng)用鏈霉素產(chǎn)品已全部退出市場[11]，加之中國梨樹多為梨火疫病感病品種[12]，導(dǎo)致該病害潛在為害流行風(fēng)險極高。因此，尋找更加高效、快速的替代藥劑迫在眉睫[13]。本試驗通過從新疆庫爾勒地區(qū)不同梨園采集的疑似梨火疫病病枝、病葉進(jìn)行病原物分離、純化、形態(tài)學(xué)特征鑒定、致病性檢驗、分子鑒定和室內(nèi)毒力測定，以期鑒定出新疆庫爾勒地區(qū)疑似梨火疫病病原菌及篩選出防治該病的室內(nèi)有效藥劑，為田間防控梨火疫病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 梨火疫病菌的分離純化、致病性測定和菌種保存

1.1.1 供試材料 采自新疆庫爾勒地區(qū)不同梨園梨樹上的疑似病枝、病葉。

1.1.2 分離純化 采用平板劃線法[14]與NSA選擇性培養(yǎng)基[12]進(jìn)行分離純化。剪取樣品病健交界處0.5 cm2組織塊，置于75%酒精中表面消毒30 s，1%次氯酸鈉中表面消毒60 s，無菌水沖洗3次后將組織塊剪碎放置培養(yǎng)皿中，倒入無菌水浸泡30 min。用接種環(huán)蘸取懸浮液在NSA培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線分離，后置入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，挑取顏色、形態(tài)一致的單菌落在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.1.3 形態(tài)學(xué)特征 將供試菌株接種于NSA選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)36～48 h[15]，NSA選擇性培養(yǎng)基由蔗糖作為碳源，利用梨火疫病病原菌在高濃度蔗糖條件下的果聚糖反應(yīng)，及蔗糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中的染料變色，產(chǎn)生了高度隆起且光滑的橘紅色菌落，據(jù)此可初步判斷為梨火疫病原菌。而后在NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)液中純化培養(yǎng)36～48 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、生長狀況及邊緣特征等。

1.1.4 致病性測定 將分離純化后的菌株接種到健康的梨樹離體葉片與海棠樹離體葉片上進(jìn)行致病性測定驗證。采摘杜梨苗枝條上4周齡以上、3～5 cm處的嫩葉，海棠枝條上4～8 cm處的葉片，用無菌水洗凈晾干，置于90 mm培養(yǎng)皿中，在正面距離葉片1～2 cm的葉柄處，采用針刺接種，并用無菌水沾濕脫脂棉，放置培養(yǎng)皿底部，每天滴加無菌水進(jìn)行保濕處理。置入28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)7 d，觀察發(fā)病情況，對發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的再分離與鑒定。

1.1.5 分子生物學(xué)驗證 根據(jù)尚琳琳等[16]已報道的檢測梨火疫病菌方法，利用北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成的特異性引物P29F(5′-ggg CAA ATA CTC ggA TT-3′)、P29R(5′-Cgg TTT TTA Acg CTg gg-3′)，將回接純化后的單菌落作為DNA模板，制作25 μL反應(yīng)體系：2×TAQ MIX：13 μL；ddH2O：10 μL；上游引物P29F：1 μL (10 μmol/L)、下游引物P29R：1 μL(10 μmol/L)，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序為：預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。以ddH2O為陰性對照，以已知梨火疫病菌為陽性對照，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收送至上海生工公司測序。

1.1.6 菌種保存 將經(jīng)過驗證鑒定為梨火疫病病原菌的菌株在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h后得到單菌落，挑取單菌落置于25 mL的NB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，用分光光度計測定OD600值為1.0～1.2的菌懸液作為試驗菌液。用配置好的80%丙三醇和試驗菌液按1∶1比例加入冷凍管內(nèi)，混勻。-20 ℃冷凍短期保存， -80 ℃冷凍長期保存。

1.2 室內(nèi)毒力測定

1.2.1 供試藥劑 本研究共測試16種藥劑。藥劑名稱、劑型、生產(chǎn)廠家詳情見表1。

表1 供試殺菌劑試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of bactericides

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2.2 供試菌株 梨火疫病菌株E.a 01由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行研究室從新疆庫爾勒地區(qū)不同梨園采摘的疑似病樣(枝、葉)中分離、鑒定并保存。

1.2.3 試驗方法 采用“藥液-菌液共培養(yǎng)法”與“抑菌圈法”兩種方法進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。

藥液-菌液共培養(yǎng)法：在NA培養(yǎng)基上將保存菌種進(jìn)行劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，并二次活化獲得單菌落。將單菌落轉(zhuǎn)入NB培養(yǎng)液中28 ℃、180 r/min繼續(xù)恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，測定OD600值為1.0～1.2時得到試驗菌懸液，并置于4 ℃冷藏，備用。按照表1中的有效成分質(zhì)量濃度梯度，將各殺菌劑依照不同稀釋倍數(shù)分別加入到50 mL無菌水中制成藥液，備用。并按20 mL藥液+2 mL菌懸液+20 mL NB培養(yǎng)液的體系混合，在28 ℃、180 r/min恒溫震蕩器中培養(yǎng)4 h制成混藥菌懸液。將不同濃度的混藥菌懸液依次按照 1×10-6CFU/mL稀釋，吸取106試管中100 μL的液體涂布于NA培養(yǎng)基中至干燥。各藥劑5個濃度，每個濃度重復(fù)3次，無菌水組為對照。 28 ℃下倒置培養(yǎng)36 h，記錄各培養(yǎng)皿中的單菌落個數(shù)，并按計算抑菌率。

抑菌圈法：試驗菌懸液的制作與“藥液-菌液共培養(yǎng)法”中的一致，并將該菌懸液進(jìn)行1×10-4CFU/mL稀釋，吸取104試管中100 μL的菌懸液涂布于NA培養(yǎng)基中至干燥。取直徑為6 mm的滅菌濾紙片以等邊三角形形式置于平板培養(yǎng)基上，每皿3片。將不同殺菌劑按照表1中的有效成分質(zhì)量濃度分別加入到50 mL無菌水中制成藥液備用。吸取6 μL不同質(zhì)量濃度的藥液滴于紙碟上。各藥劑5個濃度，每個濃度重復(fù)3次，無菌水組作為對照。28 ℃下正置培養(yǎng)36 h，使用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，按下式計算抑菌率。

以EC50值最大藥劑為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，按下式計算各殺菌劑的相對毒力指數(shù)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計整理，計算各藥劑相對毒力指數(shù)、毒力回歸方程(y=ax+b)及相關(guān)系數(shù)(R2)。使用SPSS 26.0計算供試藥劑的EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及培養(yǎng)性狀 通過劃線分離，從病害標(biāo)本上獲得純化菌株，編號為E.a01。如圖1所示，菌落在NSA選擇性培養(yǎng)基生長24～48 h后，形成橙紅色、中心顏色較深的半球狀菌落，且高度隆起，邊緣整齊，整體光滑。菌落在NA培養(yǎng)基生長24～48 h后，形成乳白色半球狀菌落，且整體隆起，邊緣整齊，表面光滑，相較于生長在NSA選擇性培養(yǎng)中的單菌落要小。菌落在NB培養(yǎng)液中生長旺盛，菌液渾濁呈云霧狀。

A～C.菌株在NSA培養(yǎng)基上生長24 h、36 h、48 h；D～F.菌株在NA培養(yǎng)基上生長24 h、36 h、48 h；G.NB培養(yǎng)液；H.菌株在NB培養(yǎng)液中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h

2.1.2 致病性測定結(jié)果 將純化后的梨火疫病菌E.a 01接種到健康的離體杜梨葉片和離體海棠葉片上，回接24 h后，兩種葉片肉眼可見針刺處發(fā)黑。48 h后，病菌從葉柄向葉脈處運(yùn)動，兩種不同植物的葉柄已全部被侵染。回接3 d后，兩種葉片上的病斑逐漸從葉脈向葉片延伸，海棠葉片侵染速度較杜梨葉片快。4 d后，病菌已侵染至杜梨葉脈三分之一處，海棠葉脈被侵染至二分之一處。回接5 d與6 d后，海棠葉片已逐漸枯黃萎蔫，兩者葉片均出現(xiàn)大面積的黑褐色火燒狀壞死，與田間發(fā)病癥狀相同，清水對照組的葉片未觀察到發(fā)病癥狀，詳情見圖2。

L-A1～L-A6.1～6 d梨葉清水對照組；L-B1～L-B6. 1～6 d梨葉回接病菌組；H-A1～H-A6.1～6 d海棠葉清水對照組；H-B1～H-B6. 1～6 d海棠葉回接病菌組

2.1.3 病原菌的分子生物學(xué)驗證 利用梨火疫病特異性引物P29F和P29R對E.a01菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段大小約900 bp的目標(biāo)產(chǎn)物，如圖3所示，與目的片段大小相似。利用BLAST軟件將測序所得P29序列與NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中已登錄的PEA29序列進(jìn)行同源序列比對，確定分離得到的單菌落為梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)。

M.Marker D 2000；+.陽性對照；-.陰性對照；1.梨火疫病單菌落E.a01

2.2 室內(nèi)毒力測定

由表2可知，16種殺菌劑對梨火疫病病原菌的室內(nèi)抑菌效果表現(xiàn)差異顯著，藥劑EC50≤15 μg/mL時，病原菌表現(xiàn)高度敏感的藥劑有4種，分別為0.3%四霉素AS、2%春雷霉素AS(江門市植保有限公司、華北制藥河北華諾有限公司)、40%春雷·噻唑鋅SC，由此表明這4種藥劑對梨火疫病病原菌的抑菌效果最好，該病原菌對這4種藥劑的敏感性最高。藥劑50 μg/mL≤EC50≤500 μg/mL時，病原菌表現(xiàn)中度敏感的藥劑有9種：4%春雷霉素SL、20%噻菌銅SC、20%噻唑鋅SC、12%噻霉酮WG、5%中生菌素WP、30%噻森銅SC、3%噻霉酮ME、3%中生菌素SL、12%中生菌素WP。藥劑500 μg/mL≤EC50≤5 050 μg/mL時，病原菌表現(xiàn)低度敏感的藥劑有2種：6%中生菌素SL、46%氫氧化銅WG。70%堿式硫酸銅WG的EC50高于10 000 μg/mL，梨火疫病病原菌對該藥劑幾乎不敏感。

表2 16種殺菌劑對梨火疫病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 2 Results of toxicity test of 16 bacteriocides against Erwinia amylovora in laboratory

(續(xù)表2 Continued table 2)

從毒力指數(shù)上看：以EC50最大的藥劑70%堿式硫酸銅WG為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，其中毒力指數(shù)均高于105的殺菌劑有0.3%四霉素AS、2%春雷霉素AS(江門市植保有限公司、華北制藥河北華諾有限公司)、40%春雷·噻唑鋅SC，表明該4種藥劑對梨火疫病病原菌的毒力最強(qiáng)。

綜上分析，16種殺菌劑對梨火疫病病原菌均有抑制作用，均可作為有效藥劑開展梨火疫病的田間藥效實(shí)驗。推薦3%四霉素AS(遼寧微科生物工程股份有限公司)、2%春雷霉素AS(江門市植保有限公司、華北制藥河北華諾有限公司)、40%春雷·噻唑鋅SC(浙江新農(nóng)化工股份有限公司)，這4種殺菌劑作為田間藥劑防治的首選 藥劑。

3 討論與結(jié)論

梨火疫病是危害梨樹的最主要細(xì)菌性病害，該病害對梨果的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大，傳染風(fēng)險高，因而，對梨火疫病的防治措施研究一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)[18]。新疆庫爾勒地區(qū)梨園發(fā)生的疑似梨火疫病癥狀，經(jīng)病原菌的分離純化、致病性測定，分子生物學(xué)驗證后，結(jié)合胡白石[12]報道的NSA培養(yǎng)基菌株培養(yǎng)性狀與生理生化反應(yīng)，確定為梨火疫病。目前化學(xué)防治是控制梨火疫傳播最常用的方法，本試驗采用“藥液-菌液共培養(yǎng)法”與“抑菌圈法”測定不同藥劑對梨火疫病菌的抑菌活性，以期為下一步的田間藥效試驗打好基礎(chǔ)。

試驗結(jié)果表明隨著殺菌劑濃度梯度的增加，抑制率均相應(yīng)的提高[19]。0.3%四霉素AS(遼寧微科生物工程股份有限公司)抑制效果最好，EC50為2.968 μg/mL，與白鵬華等[20]已報道的0.3%四霉素AS 對蘋果樹輪紋病菌的EC50為4.52 μg/mL大致相同，說明四霉素?zé)o論對真菌性病害還是細(xì)菌性病害菌具有良好的室內(nèi)抑菌活性。其次，2%春雷霉素AS(江門市植保有限公司)、2%春雷霉素AS(華北制藥河北華諾有限公司)和40%春雷·噻唑鋅SC(浙江新農(nóng)化工股份有限公司)對梨火疫病菌室內(nèi)毒力較好，且不同公司2%春雷霉素AS的EC50值相差不大。梨火疫病病原菌對4%春雷霉素SL、20%噻菌銅SC、20%噻唑鋅SC、12%噻霉酮WG、5%中生菌素WP、30%噻森銅SC、3%噻霉酮ME、3%中生菌素SL、12%中生菌素WP的9種殺菌劑處于中度敏感狀態(tài)。6%中生菌素SL、46%氫氧化銅WG和70%堿式硫酸銅WG的抑制效果較差，病原菌對這3種殺菌劑的敏感性較低。

綜上分析，0.3%四霉素AS(遼寧微科生物工程股份有限公司)、2%春雷霉素AS(江門市植保有限公司、華北制藥河北華諾有限公司)和40%春雷·噻唑鋅SC(浙江新農(nóng)化工股份有限公司)對梨火疫病菌有較好的抑制作用。需要注意的是，室內(nèi)毒力測定僅僅是藥劑對病原菌直接作用的結(jié)果，在環(huán)境相對穩(wěn)定的條件下進(jìn)行并得出結(jié)論，而實(shí)際大田種植生產(chǎn)中會受到多種因素影響，因此需進(jìn)一步進(jìn)行田間藥效驗證。本結(jié)果只限于室內(nèi)毒力測定，抑菌效果不等同于田間防治效果，但可作為田間藥劑篩選農(nóng)藥的參考依據(jù)。還需注意的是長期使用單一藥劑進(jìn)行防治有可能導(dǎo)致病菌抗性增強(qiáng)，藥效降低，所以生產(chǎn)上建議交替使用不同的殺菌劑防控梨火疫病，合理用藥，避免病原菌抗藥性的增強(qiáng)。