NLRP3炎癥小體：缺血性腦卒中的潛在治療靶點(diǎn)

張 朋， 韓榮榮綜述， 張愛梅審校

缺血性腦卒中發(fā)生后的病理生理過程非常復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、酸中毒、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、血腦屏障破壞、膠質(zhì)細(xì)胞活化和補(bǔ)體激活等。上述病理過程相互作用，形成正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦組織損傷[1]。目前，臨床上公認(rèn)的治療急性缺血性腦卒中的有效手段包括靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓[2]。然而，除了嚴(yán)格的時(shí)間窗限制外，靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓均面臨一個(gè)重要問題，那就是血管再通后由炎癥反應(yīng)引起的缺血再灌注損傷。因此，如何盡可能減輕缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥是臨床上亟待解決的問題。

近年來，人們對信號通路中的炎癥小體的關(guān)注與日俱增，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是最早發(fā)現(xiàn)的炎癥小體之一，它是檢測腦卒中后細(xì)胞損傷以及介導(dǎo)腦卒中后神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)[3，4]。針對NLRP3炎癥小體及其上下游通路的調(diào)控可能為缺血性腦卒中提供新的治療策略。因此，本文對NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)、激活、組裝和調(diào)控做一綜述并著重介紹NLRP3炎癥小體在缺血性腦卒中治療中的潛在靶點(diǎn)和國內(nèi)外最新研究進(jìn)展。

1 NLRP3炎癥小體

1.1 NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu) NLRP3炎癥小體主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等這些細(xì)胞的胞漿中，由以下三種成分組成：NLRP3受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體(pro-caspase-1)，這三種蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)炎癥小體的功能[5]。NLRP3受體蛋白屬于NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族的蛋白質(zhì)成員，由人類的22個(gè)基因家族編碼，是最典型的炎癥小體傳感器分子。NLRP3受體蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括一個(gè)位于中央的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT)，一個(gè)氨基末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)和一個(gè)羧基末端的亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)，羧基末端的LRR結(jié)構(gòu)域主要參與識別刺激，中央的NACHT結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)自身寡聚，氨基末端的PYD主要與下游同型蛋白結(jié)合。ASC由兩個(gè)相互作用結(jié)構(gòu)域組成，包括氨基末端的PYD和羧基末端CARD。Pro-caspase-1包括CARD(與ASC尾端的CARD結(jié)合)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(caspase)。在外界刺激因子的作用下，NLRP3受體蛋白、pro-caspase-1和ASC組裝成NLRP3炎癥小體，進(jìn)而誘發(fā)一應(yīng)系列炎癥反應(yīng)[5～8]。

1.2 NLRP3炎癥小體的激活和組裝 NLRP3炎癥小體的激活由以下兩個(gè)階段組成：第一階段為啟動(dòng)階段，由病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的識別所誘導(dǎo)[9]。通過激活核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路，促進(jìn)NLRP3、白介素1β前體(pro-Interleukin-1β，pro-IL-1β)和白介素18前體(pro-Interleukin-18，pro-IL-18)等蛋白的表達(dá)[10]。第二個(gè)階段為激活階段，是由組織損傷、感染或代謝失衡等一系列刺激誘導(dǎo)。在這一階段，K+外流、Na+內(nèi)流、溶酶體損傷、活性氧的生成以及線粒體功能障礙等刺激均可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝[11]。

NLRP3炎癥小體的組裝是通過NLRP3受體蛋白的PYD和ASC的PYD相互作用而啟動(dòng)的[12]。在感知到危險(xiǎn)信號后，NLRP3單體發(fā)生寡聚并通過與ASC的PYD相互作用而募集ASC，進(jìn)而形成一個(gè)大的斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)[7]。在形成斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)后，pro-caspase-1通過CARD-CARD相互作用被募集，并通過CARD-caspase接頭區(qū)域的切割而被激活[13]。至此，級聯(lián)激活的NLRP3/ASC/caspase-1多蛋白復(fù)合體，即NLRP3炎癥小體組裝完畢。具有生物活性的caspase-1將促炎細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18分別切割為成熟的IL-1β和IL-18，隨后這些成熟的細(xì)胞因子被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮促炎作用，同時(shí)，caspase-1可以解離消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)，釋放其活性N-末端片段，GSDMD的N-末端片段與細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇磷酸結(jié)合，形成一個(gè)1020 nm的孔隙，并觸發(fā)一種裂解形式的細(xì)胞死亡，稱為細(xì)胞焦亡，進(jìn)而促進(jìn)成熟的IL-1β和IL-18分泌到細(xì)胞外，最終誘發(fā)更廣泛、更強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[14](見圖1)。

2 基于NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的相關(guān)藥物及其機(jī)制

越來越多的證據(jù)表明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，這里我們總結(jié)了幾種針對NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的藥物及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制(見圖1、表1)。

表1 藥物干預(yù)NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的國內(nèi)外研究進(jìn)展

注：NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；pro-caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體；PYD：熱蛋白結(jié)構(gòu)域；NACHT：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域；LRR：亮氨酸重復(fù)序列；CARD：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；caspase：天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；NF-κB：核因子-κB；TXNIP：硫氧還蛋白相互作用蛋白；AMPK/GSK-3β：腺苷酸活化蛋白激酶/糖原合成酶激酶3β；GSDMD：消皮素D；procyanidins：原花青素；PAEs：純化的花青素提取物；immunoproteasome：免疫蛋白酶體；APNp：脂聯(lián)素肽；Hispidulin：高車前素；Evs：細(xì)胞外囊泡；Z-GS：香膠甾酮；ROS：活性氧；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-18：白細(xì)胞介素-18

2.1 NLRP3炎癥小體小分子抑制劑 MCC950是NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，Saifudeen等人證明MCC950對小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型有神經(jīng)保護(hù)作用，與對照組相比，使用MCC950處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠可顯著降低腦卒中后腦梗死以及腦水腫體積，并且降低了半暗帶區(qū)NLRP3炎癥小體裂解產(chǎn)物caspase-1以及IL-1β的表達(dá)[15]。另外一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用小鼠tMCAO模型模擬腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體主要在缺血側(cè)神經(jīng)元中表達(dá)并且誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)了急性缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，NLRP3炎癥小體的上調(diào)發(fā)生在缺血性腦卒中的早期，對應(yīng)于人類缺血性腦卒中的超急性期和急性期，使用MCC950阻斷NLRP3炎癥小體可以減輕炎癥和穩(wěn)定血腦屏障，進(jìn)而減輕缺血再灌注損傷[16]。以往的研究認(rèn)為，水通道蛋白-4調(diào)節(jié)腦組織中水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)腦水腫。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠tMCAO模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射MCC950，檢測腦組織中NLRP3、IL-1β、IL-18、GSDMD、水通道蛋白-4、內(nèi)皮素-1的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體促進(jìn)小鼠腦組織水腫以及血腦屏障破壞，腹腔注射MCC950可以降低水通道蛋白-4和內(nèi)皮素-1的水平以及調(diào)節(jié)水通道蛋白-4在梗死區(qū)的表達(dá)和分布。因此，NLRP3炎癥小體可能也是治療腦缺血再灌注后腦組織水腫的重要靶點(diǎn)[17]。綜上，MCC950作為NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑可能是一種很有前途的治療藥物，可以在腦血管閉塞以及再通后的缺血再灌注期間抑制炎癥反應(yīng)，但MCC950的治療效果和方案有待進(jìn)一步研究，以確定其是否有希望成為臨床試驗(yàn)的候選者，并且目前還沒有臨床批準(zhǔn)的針對NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，然而，有研究支持通過Bruton酪氨酸激酶抑制劑伊布替尼(PCI-32765)靶向抑制NLRP3炎癥小體的觀點(diǎn)，這或許能為缺血性腦卒中相關(guān)炎癥提供新的治療手段[18]。

2.2 NLRP3炎癥小體與自噬誘導(dǎo)劑 自噬是溶酶體參與的一種高度保守的分解代謝途徑[19]，既往的研究表明，自噬活性可以通過清除缺血腦組織產(chǎn)生的線粒體DNA和線粒體活性氧來抑制NLRP3炎癥小體的激活以及IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷[20]。因此，自噬誘導(dǎo)治療的有效性受到許多學(xué)者的關(guān)注，近年來，一些研究探討了自噬誘導(dǎo)劑對NLRP3炎癥小體調(diào)控的作用以及與缺血性腦卒中的關(guān)系。

最近的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用BV2型小膠質(zhì)細(xì)胞氧-糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型模擬缺血性腦損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)京尼平苷可降低小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模型中NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β的水平，而自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)增加，表明京尼平苷能顯著減輕OGD/R后BV-2型小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其具體機(jī)制可能是通過促進(jìn)自噬活性進(jìn)而抑制NLRP3炎性小體的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的[21]。另有研究表明，使用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性過表達(dá)過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)的轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)tMCAO模型，觀察過表達(dá)PGC-1α小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和基因表達(dá)譜以及NLRP3炎癥小體的激活和下游炎性因子的產(chǎn)生情況，采用染色質(zhì)免疫沉淀-測序技術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中PGC-1α的結(jié)合位點(diǎn)，通過對UNC-51樣激酶1(unc-51 like kinase 1，ULK1)的藥物抑制和基因組敲除來評估ULK1在缺血性腦卒中后介導(dǎo)的線粒體自噬作用，結(jié)果表明PGC-1α通過ULK1促進(jìn)自噬以及線粒體自噬活性，反過來，這個(gè)過程又進(jìn)一步抑制了由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[22]。有研究證明，糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要危險(xiǎn)因素[23]，在許多疾病中均可抑制自噬活性。采用大鼠MCAO/R模型模擬大鼠腦缺血再灌注損傷，使用GSK-3β的化學(xué)抑制劑SB216763或者GSK-3βsiRNA抑制GSK-3β在體內(nèi)的激活和表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β可通過增強(qiáng)自噬活性而抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)[24]。Luo等人證明，在大鼠tMCAO模型中，6-姜辣素通過TRPV1/FAF1復(fù)合體的解離誘發(fā)自噬進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的活化來減輕缺血再灌注損傷[25]。以上表明腦缺血后自噬活性被顯著激活且與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，自噬是負(fù)性調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的重要因素。缺血性腦卒中后通過誘導(dǎo)自噬激活，下調(diào)NLRP3/ASC/caspase-1級聯(lián)反應(yīng)信號通路，從而抑制NLRP3炎癥小體，進(jìn)而減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)。

雖然目前關(guān)于自噬與缺血性腦卒中的研究較少，但大量研究表明自噬和NLRP3炎癥小體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。因此，自噬誘導(dǎo)劑的研發(fā)可能是缺血性腦卒中后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的潛在治療方向，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.3 其他參與調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的藥物及其作用機(jī)制

2.3.1 通過TLR4/NF-κB/NLRP3途徑調(diào)控NLRP3炎癥小體的藥物 原花青素是從葡萄籽中提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[26]。在以右側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞法誘導(dǎo)的大鼠tMCAO模型中[27]，原花青素于大鼠MCAO前1 h灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原花青素能顯著改善大鼠MCAO/R所致的神經(jīng)功能缺損以及減輕腦水腫和減少腦梗死體積。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，原花青素還能顯著抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信號通路的激活以及抑制MCAO/R和OGD/R誘導(dǎo)的IL-1β等炎性細(xì)胞因子的釋放，表明原花青素可能通過抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信號通路對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。另有研究表明，在小鼠tMCAO模型模擬腦缺血再灌注損傷模型中，使用純化的花青素提取物(purified anthocyanin extracts，PAEs)治療tMCAO小鼠1周后，測定小鼠腦梗死體積、腦損傷程度以及超氧化物歧化酶等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PAEs對小鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與TLR4/NF-κB和NRFP3信號通路有關(guān)[28]。最近的一項(xiàng)研究證明，在體內(nèi)外腦缺血模型中，抑制免疫蛋白酶體可以降低NLRP3受體蛋白、ASC、caspase-1、IL-1β以及IL-18等NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，并且降低了NF-κB、焦亡相關(guān)蛋白的水平；此外，在細(xì)胞OGD/R模型中，使用NF-κB小分子抑制劑BAY-11-7082可降低NLRP3炎癥小體和caspase-1的表達(dá)，提示免疫蛋白酶體可能通過NF-κB途徑誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的表達(dá)和激活[29]。

2.3.2 通過AMPK/GSK3β/NLRP3途徑抑制NLRP3炎癥小體的藥物 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，越來越多的證據(jù)表明，AMPK激活劑可在多種炎癥損傷中發(fā)揮抗炎保護(hù)效應(yīng)。最近的研究表明脂聯(lián)素肽(Adiponectin peptide，APNp)通過調(diào)節(jié)AMPK/GSK-3β信號通路減輕腦缺血再灌注后ROS/Trx1/TXNIP相關(guān)的氧化應(yīng)激以及抑制NLRP3炎癥小體的激活，同時(shí)發(fā)現(xiàn)APNp對NLRP3炎癥小體的激活是以依賴AMPK的方式實(shí)現(xiàn)的，提示APNp在治療缺血性腦卒中方面有很大的臨床應(yīng)用潛力。然而，值得關(guān)注的是，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)APNp與其受體脂聯(lián)素受體-1在大多數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞中有共定位現(xiàn)象，提示APNp的抗炎作用可能是通過作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[30]。此外，有研究報(bào)道高車前素也可以通過調(diào)節(jié)AMPK/GSK3β信號通路，抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷，因此，高車前素可能是針對缺血性腦損傷的一種神經(jīng)保護(hù)劑[31]。

2.3.3 通過TXNIP/NLRP3通路抑制NLRP3炎癥小體的藥物 在一項(xiàng)使用OGD/R和tMCAO模型分別模擬體內(nèi)外腦缺血再灌注損傷的細(xì)胞和動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)microRNA-135a-5p在M2型小膠質(zhì)細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)中高表達(dá)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可以介導(dǎo)microRNA-135a-5p進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，通過抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達(dá)，進(jìn)一步抑制NLRP3炎癥小體的激活，從而減輕腦缺血再灌注損傷[32]。過氧化物酶體增殖物激活受體-β/δ激動(dòng)劑GW0742已被證實(shí)在多種疾病中具有抗炎作用，Marcin Gamdzyk等人證明，在大鼠缺血缺氧(hypoxia-ischaemia，HI)模型和細(xì)胞OGD模型中，GW0742可以抑制由TXNIP/NLRP3途徑介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[33]。香膠甾酮(Z-Guggulsterone，Z-GS)是一種類固醇化合物，現(xiàn)已被證明對動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥和癌癥等多種疾病有效[34]。在一項(xiàng)以大鼠MCAO模型探討Z-GS對缺血性腦卒中具體作用機(jī)制的研究中，使用微陣列分析，共鑒定出8276個(gè)差異表達(dá)基因，隨后通過趨勢分析篩選出TXNIP和NLRP3為潛在的靶基因。此外，Z-GS還成功地抑制了OGD神經(jīng)元模型的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，TXNIP基因敲除可顯著降低OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體的表達(dá)。因此，Z-GS通過抑制TXNIP/NLRP3軸減輕缺血性卒中后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有望成為未來治療缺血性腦卒中的候選藥物[35]。

3 結(jié)局及展望

綜上所述，NLRP3炎癥小體是介導(dǎo)缺血性腦卒中后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵媒介。越來越多的證據(jù)表明，從不同水平抑制NLRP3炎癥小體的活化可顯著減少腦梗死體積和改善預(yù)后。NLRP3炎癥小體的發(fā)現(xiàn)為研究缺血性腦卒中的分子機(jī)制提供了新的途徑，從不同水平調(diào)控NLRP3的組裝、表達(dá)和激活可能為挽救缺血半暗帶和改善缺血腦卒中后神經(jīng)功能惡化提供新的思路。然而，目前NLRP3炎癥小體與缺血性腦卒中的研究大多集中在動(dòng)物模型及體外實(shí)驗(yàn)，靶向抑制NLRP3炎癥小體是否對人體有效以及何時(shí)啟動(dòng)靶向治療，仍需大量的實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證。相信隨著NLRP3炎癥小體激活機(jī)制研究的不斷深入，缺血性腦卒中的治療會(huì)迎來新的機(jī)遇。