小膠質(zhì)細(xì)胞髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2及其可溶形式在肌萎縮側(cè)索硬化癥中的研究進(jìn)展

田 梅綜述， 劉亞玲審校

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)是一種表達(dá)在髓系細(xì)胞上的跨膜受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)，僅表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞表面[1]，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的一系列活動(dòng)，包括擴(kuò)增、遷移、存活、激活、吞噬[2～8]，具有抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬病理性蛋白、凋亡神經(jīng)元[9～14]等作用?？扇苄问絋REM2(soluble TREM2，sTREM2)是TREM2經(jīng)蛋白水解或異常的轉(zhuǎn)錄本翻譯而來[1]，可在血液及腦脊液中檢測[15]，不僅預(yù)示著TREM2的存在，也存在生物學(xué)作用，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活動(dòng)[16～19]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，在肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用[20]，現(xiàn)將小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2、sTREM2及其在ALS中的研究進(jìn)行綜述。

1 TREM2及sTREM2

1.1 TREM2基因結(jié)構(gòu) TREM2由位于人類染色體6p21.1上的TREM2基因所編碼。TREM2蛋白由胞外結(jié)構(gòu)域(由外顯子1-3編碼，其中外顯子1編碼一種信號(hào)肽，外顯子2編碼類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域(由外顯子4編碼)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(由外顯子5編碼)組成，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)由TREM2蛋白的三個(gè)區(qū)域共同調(diào)節(jié)[21]。在人腦中已經(jīng)報(bào)道了四種主要的TREM2基因轉(zhuǎn)錄本：即ENST00000373113、ENST00000373122、ENST00000338469和TREM2Δe2[22～24]。ENST00000373113是表達(dá)量最多、最長的TREM2轉(zhuǎn)錄本，包含上述所有5個(gè)外顯子，編碼全長230個(gè)氨基酸的跨膜受體蛋白。ENST00000373122沒有外顯子5，是第二長的轉(zhuǎn)錄本(編碼222個(gè)氨基酸)，并且其外顯子4包含一個(gè)能改變其編碼序列的替代起點(diǎn)。ENST00000338469(編碼219個(gè)氨基酸)缺失了編碼跨膜區(qū)的外顯子4。TREM2Δe2則缺少外顯子2(編碼類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)，但保留了其他外顯子，最終在膜上產(chǎn)生一個(gè)沒有與配體結(jié)合能力的非功能性受體。但值得注意的是目前尚不清楚ENST00000373122、ENST00000338469和TREM2Δe2這三種轉(zhuǎn)錄本是否在機(jī)體內(nèi)被翻譯[1]。

1.2 TREM2的配體及其下游信號(hào)通路 TREM2是免疫球蛋白超家族的跨膜受體，可以與多種配體相互作用，包括細(xì)菌產(chǎn)物、DNA、脂蛋白和磷脂等。一些配體在生理?xiàng)l件下存在于體內(nèi)，例如低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)和載脂蛋白(apolipoproteins，APOE)。在組織損傷和細(xì)胞死亡的過程中，也會(huì)釋放相應(yīng)的TREM2配體，例如，在細(xì)菌感染的情況下，TREM2通過各種表面磷脂(磷脂酰絲氨酸、心磷脂等)和糖脂(硫脂、其他腦苷脂等)結(jié)合細(xì)菌陰離子分子，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、葡聚糖硫酸鹽以及細(xì)胞碎片[9]；在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的大腦中，TREM2可以直接與病理性β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)寡聚體相互作用[25]。TREM2因缺乏免疫受體酪氨酸的活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)需要與相應(yīng)的共受體結(jié)合來發(fā)揮作用。對小鼠巨噬細(xì)胞的研究表明，TREM2與接頭蛋白DNAX激活蛋白12(DNAX activation protein 12，DAP12)和DAP10(DNAX activation protein 10，DAP10)通過跨膜區(qū)的相反電荷殘基結(jié)合。當(dāng)TREM2與配體相互作用時(shí)，這些共受體被磷酸化，形成SH2的結(jié)合位點(diǎn)，并招募細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制[9，26]。DAP12，也被稱為酪氨酸激酶結(jié)合蛋白(TYRO protein tyrosine kinase binding protein，TYROBP)，介導(dǎo)脾酪氨酸激酶Syk的激活，而DAP10通過招募磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)來促進(jìn)信號(hào)的傳導(dǎo)[9]。TREM2可與DAP12或DAP10結(jié)合，并形成TREM2-DAP12/DAP10異二聚體[26]。在小鼠巨噬細(xì)胞中，DAP12是鈣動(dòng)員所必需的，而DAP10是激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的關(guān)鍵[8，26，27]。除上述傳導(dǎo)過程外，其他信號(hào)通路也可能調(diào)節(jié)TREM2的信號(hào)傳導(dǎo)。首先，DAP12的ITAM基序可以在集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R)激活時(shí)被SRC酪氨酸激酶磷酸化[28]，因此，該信號(hào)的活性也將調(diào)節(jié)TREM2的信號(hào)傳導(dǎo)。其次，參與吞噬凋亡碎片的TAM受體(TYRO3，AXL，MER)也可以參與表達(dá)TREM2的小膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)[29]，但他們之間的相互作用尚不清楚。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞主要存在兩種不同的吞噬受體類型，一種是對外來微生物病原體具有高親和力的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)，另一種是可以識(shí)別凋亡的細(xì)胞物質(zhì)的受體TREM2[14]。有研究表明，通過DAP12的TREM2信號(hào)傳導(dǎo)可拮抗TLR的表達(dá)以及TLR介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[30，31]；相反，TREM2的表達(dá)可被LPS(作為TLR4的配體)或干擾素γ(interferon gamma，IFNγ)的促炎信號(hào)所抑制[16]。最后，有研究表明刺激核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(nuclear receptors peroxisome proliferator activated receptor，PPARγ and PPARδ)、肝X受體(liver X receptor，LXR)和維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)可以促進(jìn)小鼠TREM2和其他吞噬相關(guān)受體的表達(dá)[29]。總之，TREM2信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的過程，TREM2信號(hào)在體內(nèi)調(diào)控需要進(jìn)一步的研究。

1.3 sTREM2的產(chǎn)生 2008年，Piccio等[15]首次在人類腦脊液和血清中發(fā)現(xiàn)了sTREM2的存在。目前關(guān)于sTREM2如何產(chǎn)生，推測存在以下兩種獨(dú)立或協(xié)作的過程[1]：TREM2胞外區(qū)經(jīng)蛋白水解切割和脫落以及缺乏跨膜區(qū)的選擇性剪接的TREM2轉(zhuǎn)錄本的翻譯。去整合素和金屬蛋白酶 (a disintegrin and metalloprotease，ADAM)家族的成員，主要是ADAM10和ADAM17，在組氨酸157和絲氨酸158(H157-S158)之間催化TREM2胞外結(jié)構(gòu)域的脫落。ADAM17在THP1和CHO細(xì)胞系中sTREM2的產(chǎn)生起主要作用，而ADAM10與人類巨噬細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中sTREM2的脫落有關(guān)[32～34]。也有研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中蛋白酶meprin β可以在精氨酸136和天冬氨酸137之間(R136-D137)裂解TREM2，從而釋放sTREM2[35]。TREM2轉(zhuǎn)錄本ENST00000338469不包括編碼跨膜區(qū)的外顯子4，約占大腦中總TREM2 mRNA的25%，因此，大約20%～25%的總sTREM2蛋白可能來自該轉(zhuǎn)錄本的翻譯，而不是通過脫落酶活性切割全長的跨膜TREM2產(chǎn)生[24]。

1.4 sTREM2水平的調(diào)控及其影響因素 生理?xiàng)l件下，全長TREM2在巨噬細(xì)胞上的周轉(zhuǎn)非常迅速，半衰期不到1 h，快速、可誘導(dǎo)的產(chǎn)生sTREM2[33]。sTREM2的脫落通常發(fā)生在TREM2與配體結(jié)合后，并且新合成的TREM2蛋白需要不斷成熟并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，以維持持續(xù)的受體活性。因此，sTREM2的水平可能反映了TREM2受體與其配體的結(jié)合程度、其脫落以及新的TREM2蛋白生成及運(yùn)輸?shù)乃俣萚1]。關(guān)于增加或減少sTREM2水平的因素目前尚不清楚。有研究表明，LPS或白介素1β可以誘導(dǎo)小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞釋放sTREM2[16]；其他細(xì)胞因子如白介素13或白介素4也可以誘導(dǎo)sTREM2脫落[36]；此外，Aβ寡聚體也可以誘導(dǎo)過表達(dá)TREM2的細(xì)胞釋放sTREM2[37]。sTREM2水平受到基因及人口學(xué)因素的影響：關(guān)于基因方面，TREM2受體類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，如p. T66M和p. Y38C會(huì)導(dǎo)致TREM2的錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致未成熟蛋白質(zhì)保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，進(jìn)而使得細(xì)胞表面TREM2水平降低，脫落減少，因而體外檢測到sTREM2水平降低，而在攜帶p. R47H變異者中檢測到的腦脊液sTREM2水平卻顯著高于非攜帶者[38，39]；p. H157Y變異增加了TREM2的脫落，同樣也會(huì)導(dǎo)致sTREM2水平升高[33，34]；此外，有研究表明，11號(hào)染色體MS4A基因座附近的變異與腦脊液sTREM2水平具有相關(guān)性[40]。在人口學(xué)方面，包括年齡、性別和種族，也可能會(huì)影響腦脊液和血液sTREM2水平[1]，因而在評估sTREM2在不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用時(shí)，應(yīng)該在分析和研究設(shè)計(jì)中加以考慮。

2 TREM2、sTREM2在CNS中的功能及其在ALS中的研究

在CNS內(nèi)，TREM2僅表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞上，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增、遷移、存活、激活、吞噬[2～8]，維持小膠質(zhì)細(xì)胞的能量代謝及脂代謝[8，41]，抑制炎癥反應(yīng)[9～12]。TREM2基因突變與許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有關(guān)[1]，包括ALS[42]。對ALS小鼠模型和ALS患者死后組織的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙早在ALS癥狀出現(xiàn)之前就已發(fā)生，且TREM2信號(hào)是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的早期步驟，TREM2在反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞中被上調(diào)[20]。而sTREM2不僅預(yù)示著TREM2的存在，也存在一定的生物學(xué)作用，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活動(dòng)[16～19]。

2.1 TREM2

2.1.1 調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能 TREM2是小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子。在AD中，小膠質(zhì)細(xì)胞直接接觸和吞噬Aβ需要TREM2的介導(dǎo)[43]。在脫髓鞘模型中，TREM2激動(dòng)劑AL002a可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘的攝取和處理[44]。TREM2還可以與神經(jīng)元上的內(nèi)源性配體相互作用，并介導(dǎo)對凋亡神經(jīng)元細(xì)胞的吞噬[13]。小鼠和體外培養(yǎng)中TREM2的缺失或損傷減少了小膠質(zhì)細(xì)胞對凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片、脂蛋白和細(xì)菌的吞噬。在非吞噬細(xì)胞中的過表達(dá)TREM2，如CHO細(xì)胞，可誘導(dǎo)其對細(xì)菌、脂蛋白和細(xì)胞碎片的吞噬[9]。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)用ADAM抑制劑阻止TREM2的脫落可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘和Aβ的攝取[45]，因而依賴TREM2的吞噬活動(dòng)似乎需要全長的TREM2的作用。在Xie等[14]的研究中，利用ALS小鼠TDP-43蛋白病變模型，發(fā)現(xiàn)TREM2缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞失去了對TDP-43包涵體的吞噬能力，表明TREM2在TDP-43誘導(dǎo)的神經(jīng)變性中具有保護(hù)作用。TREM2介導(dǎo)的底物識(shí)別和吞噬的確切機(jī)制尚不清楚，推測TREM2可能作為吞噬底物的受體，直接與它們結(jié)合。

2.1.2 參與小膠質(zhì)細(xì)胞代謝 小膠質(zhì)細(xì)胞依賴糖酵解和氧化代謝來提供能量并維持其功能，TREM2通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路維持小膠質(zhì)細(xì)胞能量和生物合成代謝[46]，這可能是TREM2缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞對錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器吞噬能力降低的原因。此外，TREM2也被證明可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，在脫髓鞘模型中，TREM2缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞雖然可以正常吞噬髓鞘，但卻無法消化髓鞘脂質(zhì)，進(jìn)一步應(yīng)用單細(xì)胞RNA測序分析發(fā)現(xiàn)在TREM2缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞中，存在溶酶體降解和膽固醇運(yùn)輸相關(guān)的轉(zhuǎn)錄異常[41]。Kang等[47]在SOD1(G93A)ALS小鼠模型中觀察到軸突進(jìn)行性脫髓鞘，并且早于疾病發(fā)生。TREM2參與脂質(zhì)代謝是否與ALS的慢性脫髓鞘有關(guān)需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

2.1.3 抑制炎癥反應(yīng) TREM2的激活可以拮抗髓系細(xì)胞對促炎刺激的反應(yīng)。體外和體內(nèi)研究均表明TREM2具有抗炎作用。體外敲除TREM2削弱了白介素4誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎反應(yīng)[10]，并在LPS治療后增強(qiáng)了促炎介質(zhì)的表達(dá)，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子α、白介素1β和白介素6[11]；體內(nèi)研究表明，TREM2通過抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的P301S小鼠內(nèi)過度激活的tau激酶，而減少TREM2的表達(dá)加劇了SAMP8小鼠的衰老相關(guān)的神經(jīng)炎癥[12]。其次，在分子水平上，小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中幾個(gè)標(biāo)志性的抗炎基因以TREM2依賴的方式表達(dá)，包括Galectin-1和Galectin-3、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑、原顆粒蛋白等[9]。此外，上文中提到通過DAP12的TREM2信號(hào)可拮抗TLR的表達(dá)以及TLR介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而具有抑制炎癥的作用。CNS炎癥是ALS的特征之一，對41個(gè)來自散發(fā)性ALS患者的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)樣本的全基因組特征分析顯示：總共有1573個(gè)與炎癥相關(guān)的基因發(fā)生了變化[48]。此外，也有研究表明血液和腦脊液中的炎癥指標(biāo)與ALS存活率具有相關(guān)性[49]。因此，靶向TREM2以調(diào)節(jié)炎癥可能是治療ALS的有效方法。

2.2 sTREM2 sTREM2的脫落對TREM2受體信號(hào)的影響，以及sTREM2本身的內(nèi)源性功能，目前尚不完全清楚，sTREM2在細(xì)胞外釋放后，可通過以下方式發(fā)揮作用[1]：(1)由于胞外結(jié)構(gòu)域脫落和缺乏與配體結(jié)合能力而抑制TREM2受體的信號(hào)通路；(2) 與其他細(xì)胞(即星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞)或小膠質(zhì)細(xì)胞本身的未知受體結(jié)合，從而以自分泌方式發(fā)揮作用；(3) 阻止特定配體與膜TREM2受體的進(jìn)一步結(jié)合，最終抑制TREM2信號(hào)傳導(dǎo)。越來越多的研究表明腦脊液中sTREM2水平不但是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的生物標(biāo)志物，并且其本身即可以導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活[18，19]。sTREM2在體內(nèi)和體外均具有功能效應(yīng)：直接或通過腺病毒介導(dǎo)將sTREM2注入5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠(一種Aβ積聚的AD小鼠模型)的海馬區(qū)，sTREM2可以增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移和聚集在斑塊周圍，與Aβ結(jié)合并且可以抑制Aβ聚集，降低Aβ負(fù)荷[16]；在原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中，sTREM2可以不依賴全長TREM2，抑制細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞存活并刺激依賴于核因子-κB的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；將sTREM2立體定向注射到野生型或TREM2基因敲除小鼠的海馬區(qū)后，誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞激活的形態(tài)變化[17]。腦脊液中sTREM2的濃度與AD患者腦脊液中總tau蛋白和磷酸化tau蛋白水平具有相關(guān)性，提示腦脊液sTREM2水平可以作為神經(jīng)元損傷的替代免疫生物標(biāo)志物[9]。

在ALS患者中，腦脊液sTREM2水平顯著升高。這種升高在ALS的早期階段最為明顯。在疾病晚期，sTREM2水平與病程呈正相關(guān)，較高水平的sTREM2與疾病晚期進(jìn)展緩慢相關(guān)，表明sTREM2具有潛在的保護(hù)作用[50]。

3 治療啟示及未來的研究方向

3.1 治療啟示 TREM2基因突變可能會(huì)增加患ALS的風(fēng)險(xiǎn)，因此，糾正突變的TREM2基因可能是預(yù)防ALS的一種合理的治療策略。除了以基因組為靶點(diǎn)外，應(yīng)用外來小膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞取代小鼠體內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，或者用TREM2過表達(dá)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的小膠質(zhì)細(xì)胞替代內(nèi)源性小膠質(zhì)細(xì)胞[51，52]，可能會(huì)降低TREM2變異攜帶者發(fā)生ALS的風(fēng)險(xiǎn)或推遲疾病的發(fā)病時(shí)間。除此之外，應(yīng)用藥物干預(yù)或基因治療增加小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2的活性或表達(dá)也可能會(huì)緩解ALS相關(guān)的功能障礙，如TREM2的激動(dòng)型單抗或反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)[53，54]。有研究發(fā)現(xiàn)將純化的sTREM2直接注射或應(yīng)用表達(dá)sTREM2的病毒載體均對AD小鼠模型具有保護(hù)作用[16]，因此，此方法也可能對患有ALS的患者具有一定的保護(hù)作用。

3.2 未來的研究方向 疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(disease-associated microglia，DAM)的特點(diǎn)是穩(wěn)態(tài)基因下調(diào)，參與吞噬、脂質(zhì)代謝和溶酶體途徑的相關(guān)基因上調(diào)，且DAM具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能作為神經(jīng)變性相關(guān)分子模式的傳感器，識(shí)別包括死亡神經(jīng)元、髓鞘碎片和蛋白質(zhì)聚集體上的特定分子，進(jìn)而抑制神經(jīng)退行性病變[55，56]。轉(zhuǎn)錄研究顯示，ALS中出現(xiàn)了DAM，且與TREM2的表達(dá)呈正相關(guān)[57，58]，然而，目前對DAM在ALS中所起的作用了解有限，需要進(jìn)一步的研究來確定誘發(fā)DAM的具體誘因、TREM2信號(hào)如何在ALS中誘導(dǎo)DAM，以及在不同的疾病階段如何改變，TREM2介導(dǎo)的DAM在所有類型的ALS中是否存在。

目前關(guān)于sTREM2的確切功能以及其是否參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理依然存在爭議：sTREM2通過改善小膠質(zhì)細(xì)胞的清除作用而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但sTREM2也可以觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，這可能會(huì)對神經(jīng)元功能產(chǎn)生不利影響[16，17]；用ADAM抑制劑阻止TREM2的脫落，可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活動(dòng)[45]，sTREM2直接注射或應(yīng)用表達(dá)sTREM2的病毒載體對AD小鼠模型卻具有保護(hù)作用[16]。此外，關(guān)于sTREM2的配體和受體的了解也有限，因此，未來需要進(jìn)行更為系統(tǒng)的研究。

4 總 結(jié)

TREM2及sTREM2參與小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活動(dòng)，與ALS疾病過程有關(guān)，靶向小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2及sTREM2可能是治療ALS的一種的途徑，但我們對其在ALS不同疾病階段或不同ALS病理中的作用的了解仍然有限，因此未來需要更多深入的研究。