黃芪注射液對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的抑制作用和機(jī)制研究

程煒婷，張 婷，金秋碩，馬 喆，吳愛明，薛程元，高永紅，聶 波，趙明鏡，婁利霞

心力衰竭(heart failure，HF)是各類心血管疾病發(fā)展的終末階段和主要死因，具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)。心力衰竭時(shí)，心肌細(xì)胞缺血、缺氧，線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝紊亂，引起心肌代謝重構(gòu)和最終細(xì)胞死亡[1]。線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間的結(jié)構(gòu)耦聯(lián)，在鈣(Ca2+)信號(hào)傳導(dǎo)、脂質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝和細(xì)胞存活中起著關(guān)鍵作用。新近研究證實(shí)MAM結(jié)構(gòu)在心力衰竭的病理過程中發(fā)揮尤為重要的作用[2]。心力衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心悸”等范疇?！端貑枴つ嬲{(diào)論篇 》：“若心氣虛衰，可見喘息持續(xù)不已”，由此認(rèn)為心氣虛是心力衰竭的內(nèi)因，是病理基礎(chǔ)。故補(bǔ)益心氣是心力衰竭治療的治本之法。黃芪為臨床常用的益氣藥，在用益氣法治療心力衰竭過程中發(fā)揮著重要作用[3]。本研究采用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡模型，通過黃芪注射液干預(yù)，探討黃芪注射液是否通過調(diào)節(jié)MAM結(jié)構(gòu)蛋白電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)及分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose regulated protein 75，GRP75)的表達(dá)來抑制AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠H9c2心肌細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶購自美國Gibco公司；AngⅡ(ANGT-003)購自中國杭州中肽生化有限公司；黃芪注射液(國藥準(zhǔn)字Z13020999)購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測(cè)試劑盒(CK04)購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；動(dòng)物組織RNA提取試劑盒(DP431)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)、擴(kuò)增試劑盒(FP205-02)購自北京天根生化科技有限公司，所用引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(10149-1-AP)、Mfn2抗體(12186-1-Ap)購自美國Proteintech公司；VDAC1抗體(Ab14734)、GRP75抗體(Ab2799)購自美國Abcam公司；全蛋白提取試劑盒(KGP250)與二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測(cè)試劑盒(KGP902)購自江蘇凱基技術(shù)生物有限公司；羊抗兔(A0208)、羊抗小鼠(A0216)、Fura-2AM試劑盒(S1052)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(556547)購自美國BD公司。其他試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

千分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA1003N型)；4 ℃離心機(jī)(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，TGL-16G)；酶標(biāo)儀(深圳Rayto公司，RT-6000)；凝膠成像儀(北京原平皓生物技術(shù)有限公司，Tanon 4600)；Gene Quant紫外分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech公司)；基因擴(kuò)增儀GeneAmp PCR System 9700 (美國ABI公司，Applied Biosystems)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀Mx3000P(美國安捷倫科技公司)；流式細(xì)胞儀FC500(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠H9c2心肌細(xì)胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中置于37 ℃孵育箱培養(yǎng)。長(zhǎng)至80%～90%時(shí)去血清，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、AngⅡ模型組、AngⅡ+黃芪注射液組。正常對(duì)照組：正常孵育；AngⅡ模型組：10-7mol/L AngⅡ孵育；AngⅡ+黃芪注射液組：AngⅡ孵育濃度為10-7mol/L，同時(shí)加入0.125%黃芪注射液共同孵育。AngⅡ濃度參考文獻(xiàn)[4-5]的劑量。不同處理組細(xì)胞孵育置于37 ℃孵育箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 H9c2心肌細(xì)胞在96孔板中經(jīng)不同濃度AngⅡ或黃芪注射液孵育48 h后，每孔100 μL培養(yǎng)基中加入CCK-8母液10 μL，孵育4 h，在450 nm波長(zhǎng)處酶標(biāo)儀測(cè)定其光吸收(OD)值。其OD值可以反映其活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活性。與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)無細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白正常對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白正常對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.2 RNA提取和RT-PCR 收集不同處理后細(xì)胞，提取總RNA。加入Trizol勻漿裂解。加氯仿室溫震蕩3 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清加異丙醇，冰上放置5 min后4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清加入75%乙醇洗液沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min棄上清，室溫晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理H2O冰上溶解，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA，在 oligo(dT)15和M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Subgreen染料法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：5倍稀釋的cDNA模板5 μL，5 μmol/L正向、反向引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，H2O 5.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min，然后進(jìn)行30次擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，最后72 ℃延伸10 min。引物名稱及序列詳見表1。

表1 引物名稱及序列(5′-3′)

1.3.3 蛋白提取和蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè) 收集不同處理的細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2遍。每管細(xì)胞(106個(gè))加50 μL裂解液，超聲波破碎儀裂解后置于冰上裂解10 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。收集上清液，BCA法測(cè)蛋白定量。配制十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠，蛋白上樣。電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，結(jié)束電泳。將蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫敷育封閉1 h，加一抗GAPDH(1∶5 000)、VDAC1(1∶1 000)、Mfn2(1∶1 000)、GRP75(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗膜10 min，連續(xù)3次；二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜10 min，連續(xù)3次。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)超敏發(fā)光液顯色，使用Tanon4600凝膠成像儀進(jìn)行圖像掃描，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.4 Fura-2法細(xì)胞鈣含量檢測(cè) 大鼠H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)不同分組培養(yǎng)48 h后，依據(jù)試劑盒說明操作。用D-Hanks洗滌細(xì)胞3次，每次1 min，加2.5 μmol/L Fura-2AM于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。除去Fura-2AM工作液，用D-Hanks溶液洗滌3次，每次1 min，并放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。分別檢測(cè)340 nm、380 nm激發(fā)光下的510 nm發(fā)射光吸光度，計(jì)算兩者比值即為細(xì)胞鈣含量。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照美國BD公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I說明書，將大鼠H9c2心肌細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，在Binding buffer重懸細(xì)胞，濃度為106個(gè)細(xì)胞/mL。取100 μL，加5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻后室溫避光孵育15 min，加入Binding buffer 400 μL，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度黃芪注射液對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響 進(jìn)行體外H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)，通過CCK-8方法檢測(cè)不同濃度黃芪注射液對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，黃芪注射液在濃度為0.125%時(shí)對(duì)H9c2細(xì)胞的促增殖作用最為顯著。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.125%濃度黃芪注射液進(jìn)行細(xì)胞孵育。詳見圖1。

與對(duì)照組比較，＊P<0.05，#P<0.01。 圖1 CCK-8法測(cè)定不同濃度黃芪注射液對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響(n=6)

2.2 3組H9c2細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)比較 大鼠H9c2心肌細(xì)胞在正常孵育，10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黃芪注射液處理48 h后，收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。與正常對(duì)照組比較，AngⅡ模型組Mfn2、GRP75的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，AngⅡ+黃芪注射液組Mfn2、GRP75的mRNA表達(dá)低于AngⅡ模型組(P<0.05或P<0.01)，表明AngⅡ處理可以增加Mfn2、GRP75的mRNA表達(dá)，黃芪注射液可以抑制其表達(dá)的增高。3組VDAC1 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖2～圖4。

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與AngⅡ模型組比較，# P<0.01。 圖2 3組Mfn2 mRNA表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖3 3組GRP75 mRNA表達(dá)比較

圖4 3組VDAC1 mRNA表達(dá)比較

2.3 3組H9c2細(xì)胞目的蛋白表達(dá)比較 H9c2心肌細(xì)胞在正常孵育，10-7mol/L Ang Ⅱ及10-7mol/L Ang Ⅱ+0.125%黃芪注射液處理48 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行目的蛋白表達(dá)檢測(cè)。與正常對(duì)照組比較，AngⅡ模型組VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，AngⅡ+黃芪注射液組VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表達(dá)低于AngⅡ模型組(P<0.01)，表明AngⅡ孵育48 h可以導(dǎo)致MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2和GRP75的表達(dá)增加，而黃芪注射液可以顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VDAC1、Mfn2和GRP75蛋白表達(dá)的增加。詳見圖5～圖8。

圖5 Western Blot測(cè)定H9c2細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.01；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖6 3組VDAC1蛋白表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖7 3組Mfn2蛋白表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.01；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖8 3組GRP75蛋白表達(dá)比較

2.4 3組細(xì)胞鈣含量比較 H9c2心肌細(xì)胞在正常孵育、10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黃芪注射液處理 48 h后，進(jìn)行細(xì)胞鈣含量檢測(cè)。與正常對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞鈣含量明顯增加(P<0.05)，AngⅡ+黃芪注射液組細(xì)胞鈣含量低于AngⅡ模型組(P<0.01)，表明10-7mol/L AngⅡ處理48 h后可以導(dǎo)致細(xì)胞胞漿鈣含量顯著增加，黃芪注射液處理可以顯著抑制這種增加，調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞漿的正常鈣含量。詳見圖9。

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖9 3組細(xì)胞鈣含量比較(n=7)

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) H9c2心肌細(xì)胞在正常孵育、10-7mol/L AngⅡ及10-7mol/L AngⅡ+0.125%黃芪注射液分組處理48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)。與正常對(duì)照組比較，AngⅡ模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，AngⅡ+黃芪注射液組細(xì)胞凋亡率低于AngⅡ模型組(P<0.01)，表明AngⅡ處理細(xì)胞凋亡率較正常培養(yǎng)顯著增加，黃芪注射液可以抑制由AngⅡ引起細(xì)胞凋亡率的增加。詳見圖10、圖11。

圖10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡率

與正常對(duì)照組比較，＊P<0.01；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01。 圖11 3組細(xì)胞凋亡率比較(n=4)(A為正常對(duì)照組；B為AngⅡ模型組；C為AngⅡ+黃芪注射液組)

3 討 論

中醫(yī)治療慢性心力衰竭具有較好的臨床療效，具有多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，心氣虛是慢性心力衰竭的基本病機(jī)之一，貫穿于慢性心力衰竭的始終，是疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)提示氣與線粒體有關(guān)，氣虛可以導(dǎo)致線粒體功能障礙[6]，改善線粒體功能是進(jìn)一步提高治療慢性心力衰竭的途徑[7]。益氣是治療氣虛證的基本原則，有研究表明益氣藥能夠改善線粒體功能，進(jìn)而改善心功能，最終改善心力衰竭心氣虛癥狀[8]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的主要位點(diǎn)，MAM可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+轉(zhuǎn)移。生理狀態(tài)下，線粒體中Ca2+增加可增強(qiáng)Krebs循環(huán)和電子傳輸鏈的活性，從而激活了線粒體基質(zhì)中三磷酸腺苷(ATP)的合成[9]。線粒體Ca2+超載可引起線粒體內(nèi)膜(IMM)中線粒體通透性過度孔(mPTP)的持續(xù)打開誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)mPTP的持續(xù)打開也可導(dǎo)致電子鏈的過度激活[10]，這與活性氧(ROS)形成的增加相關(guān)。此外，線粒體鈣超載導(dǎo)致線粒體膜電位下降，基質(zhì)pH升高，而這限制了線粒體產(chǎn)生強(qiáng)膜電位的能力，從而降低ATP的合成[11]。因此，MAM的異常形成在線粒體功能障礙中發(fā)揮重要作用。此外，MAM介導(dǎo)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)血管和心肌細(xì)胞功能至關(guān)重要，因?yàn)槠淇赏ㄟ^調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)瞬時(shí)Ca2+濃度在調(diào)節(jié)動(dòng)脈和心臟的收縮功能[12]，且在心肌肥厚及其向心力衰竭發(fā)展的過程中，可以觀察到MAM的改變[13-14]。

維持MAM結(jié)構(gòu)的蛋白及蛋白復(fù)合體有很多，主要包括Mfn2、1，4，5-三磷酸肌醇受體(inositol 1，4，5-triphosphate receptor，IP3R)、VDAC1以及GRP75。其中IP3R-VDAC1-GRP75蛋白復(fù)合體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體間Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道，調(diào)控Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)。Mfn2在調(diào)節(jié)線粒體運(yùn)動(dòng)、定位、呼吸活動(dòng)、線粒體吞噬，特別是在調(diào)節(jié)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸方面起著關(guān)鍵作用[15]。研究表明，Mfn2表達(dá)缺失則會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的相互作用，線粒體Ca2+攝取和氧消耗均受到損害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加[16-17]。

臨床實(shí)踐表明，益氣藥能改善心力衰竭心氣虛證的證候表現(xiàn)，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究以MAM結(jié)構(gòu)作為研究對(duì)象，探討益氣藥黃芪注射液通過調(diào)節(jié)MAM結(jié)構(gòu)影響心肌細(xì)胞鈣平衡以及細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞比較，Ang Ⅱ處理后細(xì)胞Mfn2、GRP75的mRNA表達(dá)水平升高，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞鈣含量和細(xì)胞凋亡率升高，提示AngⅡ通過調(diào)節(jié)MAM結(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，最終影響心肌細(xì)胞凋亡。經(jīng)黃芪注射液干預(yù)后，Mfn2、GRP75的mRNA表達(dá)降低，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞鈣含量和細(xì)胞凋亡率降低，提示黃芪注射液可能通過調(diào)控MAM結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，影響MAM結(jié)構(gòu)功能、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黃芪可能通過調(diào)節(jié)MAM結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，影響MAM結(jié)構(gòu)的功能、心肌細(xì)胞鈣平衡和細(xì)胞凋亡，從而治療心力衰竭。本研究從細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器間的結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系的角度闡釋中醫(yī)藥治療心力衰竭的物質(zhì)基礎(chǔ)，為今后心力衰竭的中醫(yī)藥臨床治療機(jī)制提供新的靶點(diǎn)和研究方向。