新生兒原發(fā)性肉堿缺乏癥基因攜帶者生化和遺傳特征研究*

楊金玲，陳大宇，譚建強(qiáng)，黃麗華，韋江艷，寧海萍

廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/廣西科技大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣西柳州 545000

原發(fā)性肉堿缺乏癥(PCD)是由SLC22A5基因突變引起的脂肪酸氧化障礙，屬于一種常染色體隱性遺傳病[1]。不同國家或不同種族人群的PCD發(fā)病率大多為1/40 000～1/120 000[2]；而在法羅群島，PCD是一種常見疾病，發(fā)病率為1/300[3]。PCD患者可患有骨骼肌或心肌病、肌無力和肝性腦病，如果不規(guī)范治療，患者終身有猝死風(fēng)險(xiǎn)[4]。若進(jìn)行科學(xué)及時(shí)的規(guī)范治療，患者的大多數(shù)癥狀可逆，長期預(yù)后良好[5]。在新生兒期，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定干血斑(DBS)中游離肉堿(C0)的水平篩查PCD的報(bào)道較多，但關(guān)于PCD的遺傳特征和C0水平間關(guān)系的報(bào)道有限。新生兒DBS中C0的水平是否能提供新生兒PCD的相關(guān)信息尚不清楚。本研探討了不同SLC22A5基因突變攜帶者C0水平，為通過C0篩查PCD提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究為回顧性研究，研究對(duì)象為2017年在本院出生的新生兒。排除以下新生兒：父母拒絕進(jìn)行高通量測(cè)序者；有重大先天性異常以及妊娠期間母體有并發(fā)癥，如子癇前期、糖尿病、膽汁淤積、羊水過少和羊水過多等。共2 093例新生兒納入本研究，新生兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)是否檢出SLC22A5基因變異分為無變異基因組和攜帶變異基因組。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，將攜帶的基因變異分為一類(致病基因變異)、三類(非致病基因變異)和臨床意義未明(UVS)變異。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集出生72 h并充分哺乳的新生兒足跟血滴于S&S903TM專用濾紙片，室溫干燥后5個(gè)工作日內(nèi)遞送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2質(zhì)譜檢測(cè) 使用非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜試劑盒(廣州豐華公司)進(jìn)行游離肉堿檢測(cè)。根據(jù)試劑盒要求對(duì)DBS進(jìn)行預(yù)處理，使用串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(美國ABI 3200型)進(jìn)行分析。

1.2.3基因檢測(cè)及分析 基因檢測(cè)在北京市兒科研究所出生缺陷遺傳學(xué)研究室進(jìn)行。使用TIANamp Blood DNA試劑盒(Tiangen公司)提取DBS基因組DNA。采用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)與遺傳性代謝紊亂相關(guān)的166個(gè)已知基因的外顯子組。北京市兒科研究所出生缺陷遺傳學(xué)研究室提供二代靶向測(cè)序?qū)LC22A5基因變異的解讀報(bào)告。經(jīng)檢索PubMed上相關(guān)文獻(xiàn)、人類基因變異數(shù)據(jù)庫及ClinVar，明確致病性變異位點(diǎn)，計(jì)算人群SLC22A5基因已知致病變異攜帶率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用M(P25,P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1新生兒總體情況 2 093例新生兒中，男性1 091例，女性1 002例?；蛘＝M1 988例(94.60%)，C0水平為25.83(21.22，34.34)μmol/L；攜帶變異基因組105例(5.40%)，C0水平為24.35(19.77，29.75)μmol/L。兩組新生兒C0水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2基因分析 在2 093例新生兒中，共檢測(cè)105例新生兒攜帶35種SLC22A5基因變異。其中攜帶一類變異者20例，發(fā)現(xiàn)4種基因變異；根據(jù)出現(xiàn)頻次，依次為c.51C>G(13例)、c.1400C>G(5例)、c.338G>A(1例)、c.517delC(1例)；攜帶c.51C>G和c.1400C>G變異者占致一類變異的90%(18/20)，人群的致病變異攜帶率為1/105(20/2 093)。攜帶三類變異者18例，發(fā)現(xiàn)8種基因變異。攜帶UVS變異者75例，發(fā)現(xiàn)23種基因變異。見表1。

表1 新生兒攜帶SLC22A5基因的變異類型

續(xù)表1 新生兒攜帶SLC22A5基因的變異類型

2.3各組新生兒C0水平比較 各組新生兒出生胎齡和體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而C0水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；蛘＝MC0水平與一類變異組水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與三類基因變異組及VUS變異組水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。一類基因變異組C0水平最低，與三類變異組和VUS組C0水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三類變異組和VUS變異組C0水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組新生兒C0水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

PCD是由編碼新型有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OCTN2)的SLC22A5基因突變引起的遺傳性疾病，可導(dǎo)致肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，脂肪酸氧化受損。中國各地PCD的發(fā)病率差異較大，寧波PCD的發(fā)病率為1/16 595[6]，徐州為1/23 637[7]，廣州約為1/13 345[8]。柳州市新生兒PCD發(fā)病率為1/9 332，在脂肪酸代謝疾病中發(fā)病率最高[9]。

已報(bào)道的SLC22A5基因突變有180多種，大部分為錯(cuò)義突變，其次是無義突變和移碼突變，而剪接位點(diǎn)突變比較少見；最常見的突變是外顯子1[10]。本研究的2 093例新生兒中，檢出一類變異20例，其中c.51C>G突變發(fā)生次數(shù)為13次，占一類變異的65.0%(13/20)。c.51C>G突變?cè)诹萑巳褐芯哂休^高的攜帶率，是本研究中SLC22A5基因最常見的突變。本地區(qū)其他SLC22A5致病突變依次為c.1400C>G、c.338G>A和c.517delC。SLC22A5基因的突變熱點(diǎn)在全球不同種族和地區(qū)之間存在差異。據(jù)報(bào)道，c.760C> T變異是中國人群主要的變異，但是該變異在本研究中未被檢出，也許是研究樣本不夠大所致[11]。本研究第一熱點(diǎn)變異c.51C> G與湖南地區(qū)的相同，變異頻率高于湖南地區(qū)(27%)[12]。據(jù)報(bào)道，PCD致病性變異攜帶者3-甲基谷胱甘肽酸尿(3-MGA)升高，在沒有其他代謝物的情況下，3-MGA升高被認(rèn)為是線粒體疾病的標(biāo)志[13]。在新生兒期篩查PCD攜帶者可提示后代可能的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，亦可以提示其他線粒體疾病；同時(shí)，新生兒的攜帶者狀況提示對(duì)父母和家庭成員進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

各地廣泛采用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)DSB中C0水平來篩查PCD，診斷閾值為≤10 μmol。本研究結(jié)果顯示，檢出SLC22A5基因變異的新生兒C0水平低于基因正常的新生兒，高于該P(yáng)CD篩查的診斷閾值；一類變異組C0水平顯著低于三類變異組和UVS變異組。由此可見，通過C0水平可初步篩查PCD致病基因攜帶者。根據(jù)ACMG變異分類，常染色體因隱性遺傳病的疾病，一類基因變異的純合變異或復(fù)合/雜合變異可導(dǎo)致疾病的發(fā)生；三類變異和UVS的臨床意義未明，其純合變異或復(fù)合/雜合變異致病可能性小[14]。臨床上PCD致病基因攜帶者通常是偶然被發(fā)現(xiàn)的，通過生化檢測(cè)篩查一類變異基因的攜帶者，可以實(shí)現(xiàn)群體篩查，篩查潛在的患者，早診斷早治療，降低新生兒群體中殘疾和疾病的患病率。測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展提高了其在新生兒疾病篩查中應(yīng)用的可能性。NGS具有篩查范圍廣、靈敏度和特異度較高及高通量的優(yōu)勢(shì)[15]。但NGS在新生兒疾病篩查中應(yīng)用的費(fèi)用、檢測(cè)周期和倫理道德等方面仍然存在爭(zhēng)議。本研究提示，通過檢測(cè)新生兒DBS中C0的濃度，初步篩查可疑新生兒PCD一類變異基因的攜帶者；NGS可作為生化篩查陽性實(shí)驗(yàn)室篩查結(jié)果的確認(rèn)測(cè)試。二者聯(lián)合使用能夠快速準(zhǔn)確確定基因型，降低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及監(jiān)護(hù)人的焦慮情緒，同時(shí)為遺傳咨詢提供依據(jù)[16]。如果新生兒DBS中C0的水平低于篩查切值，靶向測(cè)序未能檢測(cè)出變異基因，提示此變異可能未在檢測(cè)范圍內(nèi)，應(yīng)根據(jù)C0的水平和臨床癥狀選擇進(jìn)一步檢測(cè)的方式。這項(xiàng)研究的一個(gè)主要局限性是僅對(duì)于靶基因編碼區(qū)的外顯子組進(jìn)行測(cè)序，無法檢測(cè)到調(diào)控區(qū)域或內(nèi)含子中的致病變異，以及無法檢測(cè)致病基因的大片段缺失/重復(fù)或拷貝數(shù)變異。最近發(fā)現(xiàn)SLC22A5基因的5′非翻譯區(qū)c.-149G>A變異被認(rèn)為是PCD的常見原因，但本研究的NGS并未涵蓋該變異[17]。

綜上所述，本研究探討了柳州地區(qū)新生兒PCD攜帶者基因型和生化表型之間的關(guān)系，為通過C0水平篩查PCD致病變異攜帶者提供依據(jù)；SLC22A5基因c.51C>G突變?cè)诒镜貐^(qū)人群中檢出率最高，屬本地區(qū)熱點(diǎn)突變。通過檢測(cè)C0水平可篩查PCD致病變異攜帶者，為篩查關(guān)口前移至一、二級(jí)預(yù)防提供依據(jù)。