1例疑難血型的血清學(xué)和基因定型處理體會(huì)

李雪晨,王加勇,陸紫敏,方 琦,鄭 浩,周 濤,丁 懿

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院輸血科，上海 20065

輸血在臨床救治患者中起著關(guān)鍵作用，血型鑒定正確是保證臨床輸血安全的重要前提?；颊咴谳斞斑M(jìn)行血型鑒定，通過(guò)正反定型一致確保ABO血型準(zhǔn)確，但病理?xiàng)l件下，尤其是惡性血液病患者，血型抗原缺失或表達(dá)減弱，會(huì)發(fā)生血型鑒定困難[1]?？?M是MSN血型系統(tǒng)常見抗體，抗-M會(huì)引起ABO血型鑒定困難與交叉配血不合，影響輸血[2]。本實(shí)驗(yàn)室使用血型血清學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)方法處理了1例同時(shí)存在上述2 種情況的患者，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1病歷資料 患者，女，65歲，漢族，因頭暈乏力，胸悶氣促，于2021年11月8日夜間到本院急診內(nèi)科就診?；颊咴谕庠捍_診為多發(fā)性骨髓瘤1年半，重度貧血貌，胸悶，明顯氣促，心率114次/min，顯著增快，雙肺呼吸音粗，左側(cè)呼吸音減弱，行胸部CT檢查提示雙肺感染。急診查血常規(guī)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)為3.05×109/L，血紅蛋白濃度(Hb)為31 g/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)為1.02×1012/L，血小板計(jì)數(shù)(PLT)為52×109/L，患者嚴(yán)重貧血，急診申請(qǐng)輸注紅細(xì)胞懸液4個(gè)單位。因患者ABO血型鑒定正反定型不一致，患者急需輸血，輸血科啟動(dòng)緊急用血應(yīng)急預(yù)案進(jìn)一步處理。

1.2儀器與試劑 ABO/Rh(D)血型定型檢測(cè)卡(西班牙GRIFOLS，批號(hào)21007.01)，不規(guī)則抗體篩檢卡(西班牙GROFOLS，批號(hào)21094.01)，凝聚胺試劑(珠海貝索，批號(hào)A201205)，抗A/抗B血型定型試劑(長(zhǎng)春博得，批號(hào)20210605)，RhD(IgM)血型定型試劑(長(zhǎng)春博得，批號(hào)SY20210201)，抗人球蛋白(抗IgG，C3d)檢測(cè)試劑(上海血液生物，批號(hào)20205001)，ABO血型反定型試劑(紅細(xì)胞，長(zhǎng)春博得，批號(hào)20210920)，不規(guī)則抗體檢測(cè)試劑(紅細(xì)胞，長(zhǎng)春博得，批號(hào)是20210918)，抗體鑒定譜細(xì)胞(上海血液生物，批號(hào)20210924)，抗-M、抗-N血型定型試劑(上海血液生物，批號(hào)20210608)，紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物，202004001)，核酸提取或純化試劑(天津秀鵬生物，202108003)，PCR儀(杭州博日，Life ECO)，核酸電泳儀(北京君意，JY300C)，核酸成像分析儀(北京君意，JYO2S)，全自動(dòng)配血及血型分析儀(西班牙GRIFOLS，WADiana)，細(xì)胞洗滌離心機(jī)(日本久保田，KA-2200)，離心機(jī)(日本久保田，2420型)，三用電熱恒溫水箱(常州翔天，XMTD-204)，冰箱(青島Haier，HYCD-205)。

1.3方法

1.3.1PCR-SSP法檢測(cè) 患者簽署同意書后，取新鮮EDTA抗凝全血2 mL，用核酸提取或純化試劑從全血中提取DNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量為20.39 ng/μL，A260/A280比值為1.76。采用PCR-SSP法檢測(cè)ABO血型基因，PCR反應(yīng)體系總體積120.9 μL，其中0.9 μL Taq酶(5 units/μL)，10 μL DNA(22 ng/μL)，110 μL dNTP-Buffer工作液，分別向紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒的引物孔(1～11孔)中各加入10 μL上述混合液。調(diào)整好反應(yīng)程序，置Life ECO型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：在96 ℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)5次；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)10次；96 ℃ 20 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)15次；72 ℃ 3 min；最后在4 ℃條件下保存。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2.5%瓊脂糖凝膠孔中，JY300C核酸電泳儀電泳15 min，在JYO2S核酸成像分析儀下觀察條帶結(jié)構(gòu)，依據(jù)結(jié)果分型表判斷血型檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2血清學(xué)試驗(yàn) ABO/Rh血型鑒定、不規(guī)則抗體篩查采用微柱凝膠卡法和試管法，抗體鑒定譜細(xì)胞檢測(cè)采用試管法，交叉配血聯(lián)合采用鹽水試管法、聚凝胺法和抗球蛋白柱凝集法，Rh分型、直接抗人球蛋白試驗(yàn)(DAT)采用試管法。實(shí)驗(yàn)操作均按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行[3]。

1.3.3吸收試驗(yàn) 將3人份O型Rh陽(yáng)性MN表型為MM的獻(xiàn)血員紅細(xì)胞混合，用生理鹽水將上述紅細(xì)胞洗滌3次，取1 mL壓積紅細(xì)胞，加入等量患者血清，4 ℃吸收2 h，每30 min搖動(dòng)1次，用離心獲得的患者血清吸收液進(jìn)行ABO血型鑒定。

2 結(jié) 果

2.1血型鑒定與抗體篩查 患者ABO血型鑒定結(jié)果見表1，正定型結(jié)果為Aweak，反定型結(jié)果為O型，試管法反定型在顯微鏡鏡下可見A1紅細(xì)胞凝集，加生理鹽水后凝集未散開，正反定型結(jié)果不一致；患者Rh血型是DCCee?；颊哐獫{與抗體篩查細(xì)胞Ⅰ和篩查細(xì)胞Ⅱ凝集，結(jié)果見表2?；颊呒t細(xì)胞做直接抗球蛋白試驗(yàn)(DAT)結(jié)果為陰性。

表1 患者ABO血型鑒定正反定型結(jié)果

表2 患者不規(guī)則抗體篩查結(jié)果

2.2PCR-SSP法檢測(cè) ABO基因分型結(jié)果見圖1，患者基因型為AO1，表型為A型。

圖1 PCR-SSP法檢測(cè)ABO基因分型結(jié)果

2.3抗體鑒定 患者血清與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)，格局為1、2、5、6、8和10號(hào)細(xì)胞均1+，3、4、7和9號(hào)細(xì)胞均陰性，自身紅細(xì)胞對(duì)照陰性。對(duì)照譜細(xì)胞試劑盒(上海血液生物，批號(hào)20210924)抗原格局表，判定患者體內(nèi)存在抗-M抗體。紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞反應(yīng)格局表見表3。

表3 紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞反應(yīng)格局表

2.4吸收試驗(yàn) 冷吸收后患者ABO血型鑒定試管法結(jié)果見表4，ABO血型為A型，正反定型一致，證實(shí)抗-M抗體存在。

續(xù)表3 紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞反應(yīng)格局表

表4 冷吸收后患者ABO血型鑒定結(jié)果

2.5交叉配血 與4個(gè)單位M抗原陰性的A型Rh分型為DCCee的紅細(xì)胞做交叉配血試驗(yàn)，主側(cè)和次側(cè)在鹽水、凝聚胺及抗球蛋白介質(zhì)中均無(wú)聚集，無(wú)溶血?；颊弋?dāng)天夜間輸注上述4 U去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞后，血紅蛋白由輸血前31 g/L上升到60 g/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)由輸血前1.12×1012/L上升到2.17×1012/L，證明輸血有效。

3 討 論

在臨床輸血治療過(guò)程中，正確的血型鑒定是確保輸血安全的首要條件。近年來(lái)，分子生物學(xué)法在ABO疑難血型鑒定中被廣泛應(yīng)用[4]。開展疑難ABO血型基因分型檢測(cè)，與血清學(xué)鑒定技術(shù)相結(jié)合，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出疑難ABO血型，順利解決疑難血型鑒定的問(wèn)題。

該患者的血型鑒定試驗(yàn)中，反定型試管法A1c、Oc在不同溫度條件下凝集強(qiáng)度一致，排除是由于冷凝集素干擾引起的正反定型結(jié)果不一致[5]。該病例為多發(fā)性骨髓瘤患者，考慮可能存在大量異常血漿蛋白干擾，反定型A1c加1滴0.9%生理鹽水混勻，在顯微鏡鏡下觀察凝集未消失，排除是由于血漿蛋白異常引起的假凝集[6]。該病例與A亞型的血清學(xué)典型特征類似，正定型中紅細(xì)胞與抗-A發(fā)生弱凝集(+1)，在反定型中與健康者的A1紅細(xì)胞發(fā)生弱凝集(+1)，疑似為A亞型[7]，本實(shí)驗(yàn)室選擇PCR-SSP法檢測(cè)ABO血型基因。

該患者ABO基因分型為AO1，表型為A型，可排除ABO亞型，患者正定型結(jié)果為Aweak，有文獻(xiàn)報(bào)道，ABO抗原減弱常見于惡性白血病，尤其在急性髓細(xì)胞白血病多見，其次是骨髓增生異常綜合征，與本病例相符[8]。該患者血清只與抗體篩查細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ反應(yīng)凝集，不是與3個(gè)抗體篩查細(xì)胞均反應(yīng)凝集，且患者直接抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果為陰性，可排除是由于自身抗體存在造成的血型定型困難[9]。本實(shí)驗(yàn)室選擇對(duì)患者進(jìn)行抗體鑒定，依據(jù)譜細(xì)胞篩查結(jié)果，判定患者體內(nèi)存在抗-M抗體。雖然患者反定型中未出現(xiàn)O細(xì)胞凝集現(xiàn)象，但吸收試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了抗-M抗體的存在，也有效消除抗-M抗體對(duì)血型鑒定的干擾，確認(rèn)患者ABO血型為A型，給患者輸注4單位M抗原陰性的A型懸浮紅懸液后，患者紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白均上升，輸血有效。

本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為輸血科在臨床輸血實(shí)踐中，開展血型基因分型檢測(cè)，可以作為血清學(xué)方法的有效補(bǔ)充，能在疑難血型的診斷中發(fā)揮重要作用，也能大大減少急診患者用血等待時(shí)間，為臨床輸血二級(jí)學(xué)科發(fā)展注入動(dòng)力，保障臨床用血安全、合理、有效。