FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中的表達研究*

譚秋芬，胡惠軍

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院,廣東惠州 516002

乳腺癌在臨床中較為常見，是一種乳腺組織惡性腫瘤，主要是致癌因子作用于乳腺上皮導致細胞異常增殖[1-2]。乳腺癌發(fā)病的性別差異性顯著，絕大多數(shù)乳腺癌患者為女性，患者發(fā)病早期多表現(xiàn)為乳頭溢液、乳房腫塊等，病情發(fā)展至晚期會出現(xiàn)癌細胞轉移情況，對患者生命造成威脅[3]。研究顯示，瓣狀核酸內切酶-1(FEN1)是一種抑癌基因，若FEN1突變，會導致其修復和復制功能改變，誘發(fā)乳腺癌[4]；轉錄因子Ⅱⅰ假基因23(GTF2IP23)是一個多功能轉錄因子，參與生物發(fā)育、細胞生長、分化、轉錄和信號轉導等，介導惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[5]；賴氨酸特異性去甲基化酶4A(KDM4A)被發(fā)現(xiàn)高表達于許多種類的癌癥中，可作為潛在的腫瘤治療的靶標[6]。本研究中對乳腺癌患者癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達進行檢測，旨在探究三者在乳腺癌中的表達相關性及聯(lián)合檢測對患者預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院于2020年7月至2021年8月進行手術的女性乳腺癌患者72例，年齡35～60歲，平均(47.5±9.8)歲，其中包括更年期患者51例，非更年期期患者21例；腫瘤直徑≤3 cm患者38例，腫瘤直徑>3 cm患者34例；無淋巴結轉移患者35例，有淋巴結轉移患者37例；無脈管侵犯患者40例，有脈管侵犯患者32例；病理分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期患者7例，Ⅳ期患者2例；癌組織分化程度：高分化32例，中分化29例，低分化11例。另選取本院同期進行手術的女性乳腺良性腫瘤患者70例，年齡36～58歲，平均(46.9±8.8)歲。本研究所有患者均知情同意并簽署知情同意書，獲本院倫理委員會批準。納入標準：(1)所有乳腺癌患者均符合中國抗癌學會對乳腺癌的診斷標準[7]；(2)均為首次確診；(3)未接受過相關治療；(4)良性乳腺腫瘤患者經(jīng)本院病理檢查確診為良性腫瘤；(5)所有患者均接受手術治療；(6)病歷資料齊全。排除標準：(1)凝血障礙者；(2)處于妊娠期或哺乳期的女性；(3)近1個月內進行過重大手術者；(4)心腦血管疾病患者；(5)精神系統(tǒng)疾病患者。

1.2方法

1.2.1標本采集 收集乳腺癌患者手術切除癌組織、距癌組織5 cm癌旁組織標本及乳腺良性腫瘤患者腫瘤病理組織，將所取病理組織分成4 mm×4 mm大小標本并清洗3次，在甲醛溶液中浸泡、固定，進行脫水，處理后石蠟包埋，之后連續(xù)切片(厚度3 μm)做免疫組化標記。

1.2.2免疫組化染色 取制備好的乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤病理組織標本，脫蠟后清洗3次，使用檸檬酸修復液(100 ℃)浸泡15 min后取出靜置冷卻，以PBS液清洗3次，添加POD阻斷劑后常溫環(huán)境下孵育30 min后再次以PBS液清洗3次，滴加山羊血清封閉，30 min后吸出封閉液、添加一抗，稀釋至1∶2 000過夜保存。次日取出后使用PBS液清洗3次，添加二抗，稀釋至1∶5 000并完全覆蓋30 min，使用PBS液清洗3次之后添加DAB液，顯微鏡觀察，蘇木精染核，反藍、脫水處理后封片。一抗：兔抗人FN1單克隆抗體、兔抗人GTF2IP23單克隆抗體購自Millipore公司，兔抗人KDM4A單克隆抗體購自Signalway Antibody(SAB)抗體公司。二抗：驢抗兔FITC(波長492～520 nm)購自Millipore公司。

1.2.3反轉錄-實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測FEN1表達 Trizol法提取總RNA并測試完整性，以18S RNA為內參，其上游引物序列為：5′-CCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-CGCCCGCCCGCTCCCAAGAT-3′；FEN1上游引物序列為：5′-AAGGTCACTAAGCAGCACAAT-3′，下游引物序列為：5′-GTAGCCGCAGCATAGACTTTG-3′,反轉錄處理后進行PCR擴增。反應條件：預變性處理10 min；變性處理95 ℃ 10 s，退火63 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 10 s，進行42個循環(huán)。2-ΔΔCt方法計算FEN1相對表達水平。儀器使用ABI7500熒光定量PCR擴增儀[購自美國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司]，F(xiàn)EN1抗體購于美國Abcam公司；所有操作均按照試劑盒說明進行。

1.2.4Western blot法檢測GTF2IP23、KDM4A表達 取待測標本，添加裂解液進行處理后取50 μg蛋白，煮至蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜處理后添加Western封閉液封閉3 h，添加一抗(1∶2 000)后4～6 ℃過夜孵育。次日使用Western液清洗后添加二抗(1∶5 000)孵育2 h，之后使用Western液進行清洗后進行顯色、曝光、成像，檢測條帶灰度值，檢測GTF2IP23、KDM4A相對表達水平。儀器使用電化學發(fā)光儀(購自上海啟步生物科技有限公司)。

2 結 果

2.1各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達差異性分析 良性腫瘤組織、乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1～3。

表1 各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平比較

圖2 GTF2IP23表達免疫組化染色圖(×400)

圖3 KDM4A表達免疫組化染色圖(×400)

2.2乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達與臨床病理特征的關系 與非更年期、腫瘤直徑≤3 cm、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移、無脈管侵犯及高、中分化患者相比，更年期、腫瘤直徑>3 cm、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、脈管侵犯及低分化患者FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達與臨床病理特征的關系

2.3乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達相關性 乳腺癌組織中FEN1與GTF2IP23、KDM4A表達呈正相關(r=0.404、0.553，均P=0.001)；乳腺癌組織中GTF2IP23與KDM4A表達也呈正相關(r=0.582，P=0.001)。見圖4。

圖4 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達相關性

2.4FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值 與單項檢測相比，3項聯(lián)合檢測的靈敏度提高，特異度輕微降低，但曲線下面積(AUC)為0.899，大于FEN1、GTF2IP23、KDM4A單項診斷(0.691、0.659、0.708)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3、圖5。

表3 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值

圖5 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值ROC曲線圖

3 討 論

乳腺癌多發(fā)生在機體乳腺上皮組織中，而在人體生命活動中，乳腺組織的作用并不十分重要，因此乳腺組織切除對乳腺癌的治療效果比較理想[8-10]。乳腺癌患者若不及時治療，病情發(fā)展至晚期，癌細胞向全身擴散，會對患者生命造成威脅。乳腺癌的發(fā)病機制有多種，包括遺傳因素、基因突變、機體免疫功能下降、神經(jīng)功能異常等，其中基因突變是乳腺癌發(fā)病的最主要因素，且腫瘤形成是一個涉及多基因、多步驟、長期的復雜過程，多種因素相互影響。因此許多專家學者通過分子生物學、病理研究等研究途徑對乳腺癌發(fā)病機制、診療靶點進行研究，對乳腺癌的診治進行不斷探索[11-13]。

FEN1是一種金屬核酸酶，具有結構特異性的特點，并且具有核酸外切酶、缺口核酸內切酶活性，能維持基因組完整、穩(wěn)定。有研究指出，F(xiàn)EN1功能喪失將會導致慢性炎癥疾病及自身免疫疾病的誘發(fā)，并且在癌組織發(fā)展進程中起重要作用[14]。有研究表示，F(xiàn)EN1在口腔癌、肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤中有著異常的表達，其變化與癌細胞增殖能力變化相關，但其在乳腺癌組織中的研究還相對較少[15-16]。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中FEN1表達相對較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，F(xiàn)EN1表達也逐漸升高，因此本研究認為FEN1在乳腺癌中高表達，可能參與乳腺癌的進展。本研究發(fā)現(xiàn)，處于恰當水平上的FEN1可通過DNA修復及抑制乳腺癌的基因突變，以保持基因組的穩(wěn)定性。另外過表達的FEN1與ER結合影響了雌激素應答基因的表達，從而加速了乳腺癌進程。說明FEN1表達變化與乳腺癌患者病理特征、病情嚴重程度密切相關，由此可以推測出FEN1可能作為乳腺癌診斷、治療的靶點應用于臨床。

GTF2IP23為GTF2I家族的重要組成成員，GTF2IP23在細胞分化、生長等生物學行為上有重要作用。有研究表示，GTF2IP23能夠激活PI3K/AKT/MAPK通路，促進癌細胞的不斷增殖分化與侵襲，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[17-18]。GTF2IP23在肺癌、結腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均異常表達。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中GTF2IP23表達相對較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中GTF2IP23表達也逐漸升高。GTF2IP23屬于GTF2I的假基因，在乳腺癌中的表達最為顯著，而假基因通過抑制其母基因的表達，調控靶基因，促使乳腺組織癌變；并通過RNA結合蛋白或其他翻譯相關機制調控RNA表達或蛋白翻譯，致使蛋白變性、癌細胞增殖，加重乳腺癌病變程度。因此本研究推測GTF2IP23可能為乳腺癌發(fā)展演進的重要靶點，檢測GTF2IP23表達對乳腺癌診斷、治療具有重要意義。

KDM4A是KDM4家族的一種重要的去甲基酶，具有一定的調控基因轉錄的作用[19]。有研究表示，KDM4A在結直腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達，其異常高表達具有促進癌細胞增殖、分化、遷移的作用，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[20-21]。本研究說明，KDM4A在乳腺癌組織中呈高表達，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中KDM4A表達也逐漸升高。KDM4A具有蛋白結合和去甲基酶活性兩種功能，可以與抑癌基因啟動子結合，負性調控癌癥因子轉錄，發(fā)揮抑癌功能，此時KDM4A升高，導致特異性蛋白1基因沉默，促使腫瘤轉移。KDM4A表達變化與乳腺癌病理特征具有密切聯(lián)系，因此本研究推測KDM4A可能為調控乳腺癌進展的重要分子。

本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中表達呈正相關，三者聯(lián)合檢測對乳腺癌患者預后預測的靈敏度提高，特異度降低，說明三者可能共同參與乳腺癌的發(fā)展演進過程，與乳腺癌疾病相關，且認為三者線性相關，推測三者可能由于共同作用而誘導疾病的發(fā)生，對乳腺癌患者預后具有較高的預測價值。

綜上所述，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中均呈異常高表達，與乳腺癌患者病理特征密切相關，且三者表達具有一定相關性，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A水平三者聯(lián)合檢測對乳腺癌患者預后具有較高的預測價值，但本文樣本例數(shù)較少，且并未分析三者之間相互作用的機制，研究存在一定的局限性，因此還需后續(xù)研究進一步分析。