原發(fā)性干燥綜合征患者唾液腺中染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子相關(guān)基因的表達分析及其與免疫浸潤的關(guān)系*

張乃丹，劉利洪，孫家祥，袁成良

德陽市人民醫(yī)院檢驗科，四川德陽 618000

干燥綜合征(SS)也稱為自身免疫性外分泌疾病，口干和眼干是SS的主要臨床表現(xiàn)。根據(jù)病因是否明確通常將該病分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種發(fā)病率較高的自身免疫性疾病，由于起病隱匿，在早期診斷方面存在困難。目前臨床治療主要以替代治療和緩解癥狀為主。關(guān)于pSS的發(fā)病機制目前尚不清楚，其中遺傳背景和免疫因素被認為是pSS發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)[1-2]。表觀遺傳學(xué)是研究基因表達可遺傳變化的一門學(xué)科，其特點為DNA序列不發(fā)生變化。表觀遺傳學(xué)機制通過調(diào)節(jié)基因表達在pSS的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子(CRs)是表觀遺傳學(xué)中不可或缺的上游調(diào)控因子，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑3大類。已有研究提示，基因突變可以干擾CRs的功能，CRs功能失調(diào)會進一步導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常并出現(xiàn)與致病相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變，最終導(dǎo)致疾病預(yù)后不佳[4]。隨著對免疫病理機制的深入研究，免疫浸潤及細胞異質(zhì)性在pSS中的研究越來越受到學(xué)者的關(guān)注。為了進一步研究CRs與pSS免疫浸潤特征的關(guān)系，本課題組嘗試從差異表達基因(DEGs)和免疫浸潤的角度進行研究，可能有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)測和診斷pSS的潛在生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 從GEO數(shù)據(jù)庫下載了3個包含pSS患者和健康對照者唾液腺基因表達陣列的數(shù)據(jù)集，分別是GSE7451、GSE23117和GSE40611。其中GSE7451包含10例pSS患者和10例健康對照者唾液腺樣本；GSE23117包含11例pSS患者和4例健康對照者唾液腺樣本；GSE40611包含17例pSS患者、14例非pSS患者和18例健康對照者唾液腺樣本。本研究最終納入38例pSS患者作為pSS組，32例健康對照者作為對照組，14例非pSS患者被排除。

1.2方法

1.2.1篩選DEGs 對所有納入研究的基因表達陣列采用R語言(版本號4.0.3)進行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)合并、歸一化和log2對數(shù)轉(zhuǎn)換，最終得到22 189個基因的表達情況。當(dāng)多個探針對應(yīng)同一基因時，取其平均值作為表達值。本研究采用代理變量分析(SVA)程序包消除批量效應(yīng)。通過查閱已有文獻，共收集了870個CRs相關(guān)基因的信息，并將P<0.05和|log2FC|>0.50設(shè)為篩選DEGs的條件，F(xiàn)C為倍數(shù)改變。采用LIMMA程序包篩選CRs相關(guān)的DEGs[5]。

1.2.2基因本體論(GO)對DEGs的富集分析 本研究使用enrichment plot程序包對DEGs進行GO富集分析。GO富集分析將分別從生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能3方面進行分析。使用barplot程序包繪制條形圖。對于差異有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)，展示前4條分析結(jié)果；對于差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果不進行展示。

1.2.3免疫細胞和免疫功能的相關(guān)性分析 為了評估pSS患者唾液腺免疫微環(huán)境的變化情況，采用基因集變異分析(GSVA)計算出上述3個唾液腺基因表達陣列中共22 189個基因的變異分數(shù)。通過GSEA官網(wǎng)下載并整理了與16種免疫細胞與13種免疫功能相關(guān)的基因集。采用ssGSEA算法分析上述2個數(shù)據(jù)集并取交集，計算免疫浸潤評分，比較對照組與pSS組免疫細胞和免疫功能的評分差異。采用corrplot程序包分別分析16種免疫細胞與13種免疫功能的相關(guān)性并繪制相關(guān)性熱圖。采用相關(guān)系數(shù)來評價免疫細胞與免疫功能的相關(guān)性，分為極強相關(guān)、強相關(guān)、中等相關(guān)、弱相關(guān)和極弱相關(guān)。16種免疫細胞包括樹突狀細胞(DCs)、活化的樹突狀細胞(aDCs)、未成熟樹突狀細胞(iDCs)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)、B細胞、T輔助細胞、細胞毒性(CD8+)T細胞、濾泡輔助性T細胞(Tfh)、1型輔助性T細胞(Th1)、2型輔助性T細胞(Th2)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、NK細胞、巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞。13種免疫功能包括抗原提呈細胞(APC)共抑制、APC共刺激、CC趨化因子受體(CCR)、免疫檢查點、細胞殺傷活性、T細胞共抑制和共刺激、人白細胞抗原(HLA)、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC Ⅰ類)、炎癥反應(yīng)、副炎癥反應(yīng)、Ⅰ型和Ⅱ型干擾素反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1DEGs篩選 本研究共篩選出11個與CRs相關(guān)的DEGs，其中10個基因上調(diào)，1個基因下調(diào)。上調(diào)居前5位的DEGs分別是干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列蛋白3、載脂蛋白B MRNA編輯酶催化亞基3G(APOBEC3G)、SP110、E2泛素結(jié)合酶家族D1(UBE2D1)和SMCHD1，下調(diào)基因為EYA3，差異表達的火山圖見圖1。

注：綠色表示顯著下調(diào)(P<0.05)，黑色代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，紅色表示顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.2GO富集分析在DEGs中的應(yīng)用 對篩選出的11個DEGs進行GO分析，找出DEGs頻率最高的4種生物學(xué)過程，包括正向調(diào)控DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)DNA損傷刺激反應(yīng)、非同源端連接修復(fù)雙鏈DNA和DNA修復(fù)。細胞組分功能富集前4位依次為性染色體、PML核體、染色體端粒和核心蛋白復(fù)合體。分子功能由于未富集到DEGs，暫無數(shù)據(jù)展示。

2.3免疫浸潤評分及相關(guān)性分析 本研究采用ssGSEA算法，共獲得了16種免疫細胞和13種免疫功能的免疫浸潤評分。在16種免疫細胞中，免疫浸潤評分相關(guān)性排前5位的組合分別為TIL和B細胞(r=0.90,P<0.001)、Tfh和TIL(r=0.72,P<0.001)、B細胞和Tfh(r=0.70,P<0.001)、pDCs和TIL(r=0.69,P<0.001)、Treg和TIL(r=0.68,P<0.001)。在13種免疫功能中，免疫浸潤評分相關(guān)性排前5位的組合分別為免疫檢查點和T細胞共刺激(r=0.92,P<0.001)、免疫檢查點和CCR(r=0.89,P<0.001)、免疫檢查點和T細胞共抑制(r=0.88,P<0.001)、CCR和T細胞共刺激(r=0.86,P<0.001)、CCR和T細胞共抑制(r=0.82,P<0.001)。見圖2。

注：A為免疫細胞的相關(guān)性分析；B為免疫功能的相關(guān)性分析；方格內(nèi)數(shù)字代表相關(guān)系數(shù)，紅色代表正相關(guān)，藍色代表負相關(guān)。

2.4對照組與pSS組的免疫浸潤評分比較 對pSS組和對照組分別進行了免疫細胞和免疫功能的免疫浸潤評分差異分析。16種免疫細胞中，9種免疫細胞的免疫浸潤評分(pSS組vs.對照組)顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為aDCs、中性粒細胞、pDCs、TIL、Treg、B細胞、巨噬細胞、輔助性T細胞和Th2細胞。在13種免疫功能中，8種免疫功能顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為HLA、炎癥反應(yīng)、MHCⅠ類分子、副炎癥反應(yīng)、Ⅰ型干擾素反應(yīng)、APC共抑制、CD8+T細胞殺傷活性和T細胞共抑制。見圖3。

注：A為免疫細胞的免疫浸潤評分；B為免疫功能的免疫浸潤評分；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

pSS是一種以特異性病理損害為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。早期對pSS相關(guān)的DEGs研究主要集中在與信號通路的相關(guān)性分析、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)等方面[5-7]。從DEGs中篩選CRs相關(guān)基因并從免疫浸潤的角度來進行的研究比較少見。本研究結(jié)果顯示，在pSS患者唾液腺中，與CRs相關(guān)的DEGs以表達上調(diào)為主，表達下調(diào)的DEGs較少。干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列蛋白3(IFIT3)是一種蛋白編碼基因，在干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要的作用。高表達IFIT3通過線粒體抗病毒信號途徑(MAVS)和干擾素基因刺激物途徑(STING)介導(dǎo)TANK結(jié)合激酶1(TBK1)活化，促進干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)從胞漿轉(zhuǎn)位到細胞核，導(dǎo)致Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[8]。Ⅰ型IFN與其受體結(jié)合，介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)磷酸化，促進干擾素誘導(dǎo)基因(ISGs)的表達[9]。已有研究通過靶向TBK1抑制劑治療pSS后發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型IFN陽性患者外周血單個核細胞(PBMCs)表達的IFIT3較陰性患者顯著降低[10]。上述研究提示，IFIT3在Ⅰ型IFN信號通路調(diào)節(jié)中具有重要作用。本研究結(jié)果提示，與健康對照者相比，pSS患者Ⅰ型干擾素反應(yīng)免疫浸潤評分顯著升高，提示IFIT3基因可能在pSS患者唾液腺損害中具有一定的作用。

APOBEC3G屬于APOBEC3家族，具有催化RNA和單鏈DNA的位點特異性脫氨基的作用。APOBEC3通過基因突變，導(dǎo)致DNA損傷和細胞周期停滯，在IFN刺激下，APOBEC3相關(guān)蛋白在單核細胞和巨噬細胞中大量表達，出現(xiàn)高水平的循環(huán)DNA，加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。本研究通過對pSS患者唾液腺免疫浸潤的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在pSS患者中顯著升高，同時炎癥反應(yīng)也顯著高于健康對照者，這與已有研究結(jié)果一致。SP110基因是SP110核蛋白的編碼基因，SP110核蛋白可作為基因轉(zhuǎn)錄的激活劑，在核糖體產(chǎn)生和誘導(dǎo)骨髓細胞分化中發(fā)揮了重要作用[12]。UBE2D1通過與E1泛素激活酶和E3泛素蛋白連接酶相互作用，參與調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。已有研究提示，UBE2D1與pSS患者抗Ro52抗體的E3泛素蛋白連接酶活性有關(guān)[13]。目前暫無關(guān)于SMCHD1基因在pSS中的相關(guān)研究，由于本研究納入的樣本量偏少，關(guān)于CRs相關(guān)基因在pSS中的篩選還需要納入更多樣本，進行多中心的驗證。

關(guān)于免疫微環(huán)境在pSS發(fā)生發(fā)展中的研究越來越受到學(xué)者重視。本研究采用ssGSEA算法將免疫細胞浸潤評分擴展到16種常見的免疫細胞，并增加了13種免疫功能分析。結(jié)果顯示，在pSS患者中存在免疫微環(huán)境的異?；罨⑶耶惓；罨亩喾N免疫細胞和免疫功能評分均顯著高于健康對照者(P<0.05)。這些免疫浸潤模式可能為pSS免疫治療提供重要線索。首先，本課題組研究了這些具有顯著性差異的免疫細胞之間以及免疫功能之間是否具有一定的相關(guān)性，這是一個創(chuàng)新的嘗試，以便更全面了解pSS患者免疫微環(huán)境的特點。在16種免疫細胞中，相關(guān)性較強的為TIL和B細胞，其次為Tfh和TIL。TIL主要由CD8+T淋巴細胞和三級淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)的B細胞組成，并能夠產(chǎn)生Tfh細胞。功能實驗提示活化的Tfh是激活TLS內(nèi)免疫球蛋白和IFN-γ產(chǎn)生的重要因素[14]。Tfh在維持B細胞生存和分化過程中具有重要作用，在高度局灶性淋巴細胞性唾液腺炎的pSS患者中，循環(huán)Tfh細胞的CCR7loPD-1hi亞群增加，并與ESSDAI疾病活動度評分和活化的B細胞顯著相關(guān)[15]。而在13種常見的免疫功能中，相關(guān)性較強的為免疫檢查點和T細胞共刺激、免疫檢查點和CCR。已有研究提示，通過對骨肉瘤患者相關(guān)免疫功能，包括APC共抑制、CCR、免疫檢查點與T細胞共刺激等進行評分，有助于預(yù)測患者對放療的反應(yīng)性和總體存活率[16]。目前關(guān)于免疫功能評分在pSS患者治療監(jiān)測和預(yù)后中的研究較少，因此本課題組也進一步比較了pSS患者與對照組免疫浸潤評分的差異。本研究發(fā)現(xiàn)pSS患者有多種免疫細胞，包括aDCs、巨噬細胞、Treg、CD8+T細胞、中性粒細胞、B細胞、Tfh和TIL，以及多種免疫功能，包括MHC Ⅰ類、HLA、Ⅰ型IFN反應(yīng)、副炎癥反應(yīng)等顯著高于健康對照者。已有研究發(fā)現(xiàn)，在pSS患者中，記憶B細胞、Tregs和aDCs的比例顯著升高，并可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者唾液中干擾誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)和巨噬細胞炎性蛋白(MIP)顯著升高，并與臨床口腔表現(xiàn)的嚴(yán)重程度有關(guān)，提示巨噬細胞和先天免疫在pSS發(fā)病機制中具有重要作用[18]。對CD8+T細胞的研究提示，pSS模型中浸潤性CD8+T細胞明顯多于CD4+T細胞，減少CD8+T細胞的浸潤可有效減少對唾液腺的破壞[19]。此外，通過對pSS患者唾液腺中Tfh亞群進行分析，發(fā)現(xiàn)Tfh1、Tfh2和Tfh17細胞在pSS患者唾液腺樣本中百分比較高，抗Ro/SSA抗體與Tfh17亞群呈正相關(guān)，并且(Tfh2+Tfh17)/Tfh顯著高于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，提示pSS與系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有差異性的Tfh譜[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)的異?；罨拿庖吖δ芘c以往文獻報道不盡一致[17-20]。一項使用微陣列分析唾液腺中基因表達的研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者基因表達模式涉及多種慢性炎癥通路，包括趨化因子、細胞因子、MHC和IFN[21]。與以往研究不同的是，本研究還發(fā)現(xiàn)免疫功能中的副炎癥反應(yīng)的免疫浸潤評分顯著上調(diào)。在腫瘤細胞系中，副炎癥反應(yīng)具有某些正常巨噬細胞的功能，它可以根據(jù)腫瘤的需要模擬不同的免疫亞群。此外，本研究中巨噬細胞的免疫浸潤評分也顯著上調(diào)，提示未來對副炎癥反應(yīng)的研究也可能為pSS的治療提供重要線索。

本研究存在一定的局限性。因為本課題組主要關(guān)注的是目前文獻已經(jīng)報道過的CRs相關(guān)基因在pSS中與免疫浸潤的關(guān)系，可能忽略了目前文獻尚未報道的基因。其次，本研究納入的樣本量較少，對免疫浸潤評分未進一步進行驗證，在今后的研究中，還將對上述CRs相關(guān)基因進行功能實驗，以明確CRs在pSS致病過程中的作用。

綜上所述，CRs相關(guān)基因雖然在pSS患者唾液腺中的DEGs數(shù)量較少，但是與受損唾液腺的免疫浸潤異常有關(guān)，值得臨床醫(yī)生的關(guān)注。