SLAMF6、BCL-2/Bax對重型再生障礙性貧血患者HSCT療效的預(yù)測價值分析*

劉曉燕，劉文超，尹婷婷

邯鄲市第一醫(yī)院：1.血液內(nèi)科；2.老年病一科，河北邯鄲 056000

重型再生障礙性貧血(SAA)是骨髓造血功能衰竭引起的一種血液系統(tǒng)重癥，具有發(fā)病急、進(jìn)展快及病死率高等特征[1]。目前,強(qiáng)化免疫抑制治療及造血干細(xì)胞移植(HSCT)是臨床治療SAA的重要手段，但前者初次治療失敗率可達(dá)30%以上，且治療有效的患者亦存在10%～20%的復(fù)發(fā)風(fēng)險，而HSCT優(yōu)勢在于造血重建快，長期生存率可達(dá)70%以上，且多數(shù)無需維持治療，治療更徹底[2-3]。臨床數(shù)據(jù)顯示，影響SAA患者HSCT療效的主要因素有移植物抗宿主病、感染、出血等并發(fā)癥，而HSCT治療后中性粒細(xì)胞及血小板植活情況與上述并發(fā)癥發(fā)生或存在直接關(guān)系[4-5]。因此，早期預(yù)測HSCT療效不僅有助于積極完善干預(yù)策略提升患者獲益率，改善生存狀況，且利于節(jié)約醫(yī)療資源，減輕社會及家庭負(fù)擔(dān)。B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax蛋白)是一對與細(xì)胞凋亡平衡有關(guān)蛋白，多項(xiàng)研究顯示，BCL-2/Bax與骨髓造血功能有關(guān)[6-7]。信號淋巴細(xì)胞激活分子家族6(SLAMF6)主要在NK、T、B等免疫細(xì)胞中表達(dá)，其主要有負(fù)調(diào)控自身免疫功能的作用[8]。EISENBERG等[9]研究顯示，SLAMF6可通過激活CD8+T淋巴細(xì)胞而參與腫瘤免疫的生物學(xué)過程。CD8+T淋巴細(xì)胞作為SAA的重要效應(yīng)細(xì)胞，SLAMF6的異常表達(dá)是否與SAA患者HSCT療效有關(guān)尚無定論。本研究通過探討SAA患者HSCT治療前后外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax變化，旨在為臨床完善HSCT療效評估機(jī)制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年3月至2020年10月于本院接受HSCT治療的SAA患者56例納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合SAA診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，至少滿足以下項(xiàng)目中的2項(xiàng)，①網(wǎng)織紅細(xì)胞<1%，絕對計(jì)數(shù)<15×109個/L，②中性粒細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)<0.5×109個/L；③血小板<2×109個/L；(2)無其他血液疾病及免疫性疾??；(3)對本研究內(nèi)容知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前1周內(nèi)有免疫調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇激素用藥史；(2)妊娠；(3)有嚴(yán)重肝腎心功能障礙；(4)有肺部等活動性感染。

1.2方法

1.2.1HSCT治療 患者入院完善對應(yīng)檢查，明確是否有HSCT禁忌證及適應(yīng)證。預(yù)處理：兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白[enzyme Europe B.V.，S20150035，規(guī)格：25毫克/瓶(每瓶含兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白25 mg,復(fù)溶后體積5 mL)，3.5 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d]+氟達(dá)拉濱(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20064228，規(guī)格：50 mg，30 mg/m2，連續(xù)5 d)+環(huán)磷酰胺[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020857，規(guī)格：0.2 g，60 mg/(kg·d)，連續(xù)2 d]。移植物抗宿主病防范：全相合移植者予以環(huán)孢素A+短程甲氨蝶呤。造血干細(xì)胞動員、采集、回輸：供者皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)300 μg/d，連續(xù)4 d，第5天采集骨髓回輸，次日COBE血細(xì)胞單采機(jī)[?？松?北京)科技有限公司]分離外周干細(xì)胞，回輸。移植前2周，靜滴更昔洛韋預(yù)防巨細(xì)胞病毒感染，予以肝保護(hù)藥物預(yù)防肝靜脈阻塞綜合征，移植前1 d予以抗感染預(yù)防性治療，移植后的白細(xì)胞低谷期服用立康唑片，移植后7～10 d靜脈用丙種球蛋白。定期檢測巨細(xì)胞病毒感染，予以靜脈營養(yǎng)及對癥支持治療等。HSCT后1年內(nèi)每隔3個月全面體檢1次。HSCT療效評價：中性粒細(xì)胞植活標(biāo)準(zhǔn)為首次連續(xù)3 d中性粒細(xì)胞絕對值>0.5×109/L；血小板植活標(biāo)準(zhǔn)為脫離血小板輸入，且連續(xù)7 d血小板計(jì)數(shù)>20×109/L。

1.2.2指標(biāo)檢測 (1)外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量：采用肝素抗凝真空管采集肘靜脈4 mL。實(shí)驗(yàn)管加特異性抗體鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC、SLAMF6-PE分別5 μL，同時對照管加特異性抗體鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC及同型對照抗體PE-IgG1分別5 μL，每管加所采集外周血標(biāo)本100 μL，混勻，孵育15 min(4 ℃避光)，加溶血素1 mL，室溫避光溶解紅細(xì)胞(8 min)，離心，棄上清，PBS洗2次，上機(jī)測SLAMF6表達(dá)量。(2)BCL-2/Bax：非抗凝真空管采集肘靜脈血4 mL，離心10 min(9 000×g)，取上清，孵育2 h(37 ℃)，加BCL-2、Bax抗體，孵育2 h(37 ℃)，加底物，孵育30 min(37 ℃)，測吸光度(A)值，標(biāo)準(zhǔn)曲線下獲得BCL-2、Bax水平，然后計(jì)算BCL-2/Bax。

1.3觀察指標(biāo) (1)HSCT后隨訪1年評價療效，包括中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間及并發(fā)癥發(fā)生率。(2)不同療效患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平。(3)分析外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平與中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間的相關(guān)性。(4)比較不同類型患者的中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間。(5)采用多元線性回歸分析中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間的影響因素，并建立回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1HSCT治療效果分析 56例SAA患者經(jīng)HSCT治療，中性粒細(xì)胞植活時間8～23 d，平均(15.38±3.76)d；血小板植活時間7～173 d，平均(89.65±22.64)d。27例患者HSCT治療后1年內(nèi)出現(xiàn)移植物抗宿主病，發(fā)生率48.21%，其中Ⅰ度14例(51.85%)，Ⅱ度9例(33.33%)，Ⅲ度4例(14.81%)。感染16例，發(fā)生率28.57%，出血9例，發(fā)生率16.07%。無病死病例。以中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間均值為界，高于均值的患者移植物抗宿主病、感染并發(fā)癥發(fā)生率更低(P<0.05)。見表1。

表1 HSCT治療效果分析

2.2不同HSCT治療效果的患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平比較 56例SAA患者經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6的表達(dá)量為(58.02±11.87)%，BCL-2水平為(0.42±0.10)μg/L，Bax水平為(0.37±0.08)μg/L，BCL-2/Bax為1.14±0.28。中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間高于均值的患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6的表達(dá)量和血清BCL-2水平、BCL-2/Bax較低，Bax水平較高(P<0.05)。見表2。

表2 不同HSCT治療效果患者外周血CD8+ T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平比較

2.3外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平與中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間相關(guān)性 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量與中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.803、-0.707，均P<0.001)；BCL-2/Bax與中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.802、-0.680，均P<0.001)，見圖1～4。

圖1 SLAMF6與中性粒細(xì)胞植活時間的關(guān)系

圖2 BCL-2/Bax與中性粒細(xì)胞植活時間的關(guān)系

2.4不同類型患者中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間比較 有主要臟器功能不全、移植物抗宿主病及CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平較高者中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間更長(P<0.05)。見表3。

表3 不同類型患者的中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間比較

2.5多元線性回歸分析 經(jīng)多元線性回歸分析，篩選出與中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間有線性關(guān)系的因素：CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax對應(yīng)的線性系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。建立中性粒細(xì)胞植活時間回歸模型：中性粒細(xì)胞植活時間=35.807-0.325×SLAMF6-1.255×BCL-2/Bax，回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.31，P<0.001)，自變量可解釋中性粒細(xì)胞植活時間89.2%(R2=0.894，調(diào)整R2=0.892)的變異量。建立血小板植活時間回歸模型：血小板植活時間=67.220-2.999×SLAMF6-19.704×BCL-2/Bax，回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.04，P<0.001)，自變量可解釋血小板植活時間92.5%(R2=0.927，調(diào)整R2=0.925)的變異量。見表4、圖5～6。

圖3 SLAMF6與血小板植活時間的關(guān)系

圖4 BCL-2/Bax與血小板植活時間的關(guān)系

續(xù)表3 不同類型患者的中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間比較

表4 多元線性回歸分析

圖5 中性粒細(xì)胞植活時間實(shí)際值與預(yù)測值

3 討 論

HSCT是當(dāng)前重建SAA患者骨髓造血功能，確?；颊吣荛L期生存的主要手段。盡管HSCT前已有標(biāo)準(zhǔn)預(yù)處理方案，但不同SAA患者HSCT效果不盡相同，如中性粒細(xì)胞及血小板植活時間存在差異[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HSCT治療效果不盡相同，尤其是血小板植活時間最長近6個月，而中性粒細(xì)胞及血小板植活時間越短的患者并發(fā)癥發(fā)生率越低，患者獲益更大。此與近年研究結(jié)論一致[12]。因此，有效評估SAA患者HSCT治療的時效性對指導(dǎo)臨床積極完善干預(yù)策略至關(guān)重要。

目前SAA致病機(jī)制尚未完全明確。多數(shù)報道表明，此疾病的發(fā)生、發(fā)展可能與自身免疫所致造血干細(xì)胞損傷有關(guān)[13-14]。同時機(jī)體移植排斥反應(yīng)也是HSCT能否成功的主要決定因素[15]。由此可見，機(jī)體免疫相關(guān)調(diào)控機(jī)制或與HSCT后中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間有關(guān)。SLAMF6是表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面的一種跨膜糖蛋白受體，對淋巴細(xì)胞分化、功能具有調(diào)節(jié)作用，其參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)病過程[16]。有研究通過基因敲除技術(shù)證實(shí)，SLAMF6-/-小鼠Th1類細(xì)胞因子增加，而Th1類細(xì)胞因子缺失，并得出SLAMF6可能在機(jī)體免疫中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞及血小板植活時間較長患者外周血SLAMF6呈低表達(dá)狀態(tài)。據(jù)此推測，SLAMF6低表達(dá)可能會造成機(jī)體免疫過度而影響中性粒細(xì)胞及血小板順利植入。分析原因，主要是造血干細(xì)胞作為移植物進(jìn)入機(jī)體后可激發(fā)機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，而SLAMF6低表達(dá)可直接造成Th1/Th2平衡偏移，并引起Th1細(xì)胞過度增殖及生成、釋放白細(xì)胞介素-2、γ干擾素等多種細(xì)胞因子，加重造血干細(xì)胞免疫損傷。另外，研究顯示，初治SAA患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表面SLAMF6低表達(dá)，而CD8+T淋巴細(xì)胞及其效應(yīng)因子水平顯著升高[19]。據(jù)此認(rèn)為，SLAMF6低表達(dá)可能會造成“殺手”CD8+T淋巴細(xì)胞過度激活而增加中性粒細(xì)胞及血小板植活難度。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SLAMF6表達(dá)與中性粒細(xì)胞及血小板植活時間呈負(fù)相關(guān)，且是二者植活時間的獨(dú)立因素，說明SLAMF6或可作為臨床評估HSCT療效的客觀依據(jù)。

BCL-2/Bax決定細(xì)胞“命運(yùn)”。研究顯示，BCL-2/Bax水平升高預(yù)示細(xì)胞生命延長，否則細(xì)胞凋亡加速[20]。廖亮英等[21]研究顯示，可通過調(diào)節(jié)BCL-2、Bax表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞移植大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，BCL-2/Bax值低時，SAA患者中性粒細(xì)胞及血小板植活時間延長，提示BCL-2/Bax值可能與HSCT療效有關(guān)。但有研究指出，中性粒細(xì)胞及血小板植活情況是多因素作用的結(jié)果，如移植前巨細(xì)胞病毒血癥、營養(yǎng)狀態(tài)均是其影響因素[22-23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，移植物抗宿主病與HSCT療效有關(guān)，但校正混雜因素后，僅SLAMF6、BCL-2/Bax進(jìn)入方程，提示SLAMF6、BCL-2/Bax是HSCT療效的獨(dú)立因素。分析可能的原因：(1)BCL-2能抑制細(xì)胞程序性凋亡，參與細(xì)胞線粒體、核孔復(fù)合體信號傳遞，且能通過改變線粒體外膜通透性而調(diào)節(jié)促細(xì)胞凋亡因子的釋放，而Bax作為BCL-2蛋白家族主要成員之一，是一種促細(xì)胞凋亡蛋白。因此，BCL-2/Bax值降低時可能會造成新植入造血干細(xì)胞增殖、分化受影響，以致中性粒細(xì)胞及血小板植活時間延長。(2)研究證實(shí)，SAA患者血超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平呈異常狀態(tài)，氧化應(yīng)激參與此疾病發(fā)生發(fā)展過程[24]。BCL-2是一種重要抗氧化劑，可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境氧化還原狀態(tài)，減輕或阻斷細(xì)胞及其組分被氧化損傷，而BCL-2低水平狀態(tài)或直接造成造血干細(xì)胞受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)而衰老。上述研究表明，BCL-2/Bax水平與HSCT療效關(guān)系密切。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平可解釋中性粒細(xì)胞植活時間及血小板植活時間的變異量均達(dá)89%以上，說明SLAMF6、BCL-2/Bax可為臨床評估HSCT療效提供客觀依據(jù)。但HSCT治療后病情轉(zhuǎn)歸復(fù)雜，除與患者原生免疫系統(tǒng)有關(guān)外，還與供者干細(xì)胞分化及增殖而來的中性粒細(xì)胞有關(guān)，當(dāng)其將自身組織作為“異物”產(chǎn)生免疫排斥時亦會影響HSCT整體效果，而患者CD8+T淋巴細(xì)胞SLAMF6表達(dá)量、BCL-2/Bax水平是否與此免疫反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)仍需繼續(xù)探討。

綜上可知，SAA患者SLAMF6與BCL-2/Bax表達(dá)下調(diào)會延長HSCT治療后中性粒細(xì)胞植活時間、血小板植活時間，二者可作為預(yù)測HSCT療效的指標(biāo)。