西南金絲梅中結(jié)構(gòu)新穎的PPAPs類化合物

胡鳳成，齊若羽，韋 博，湯江江，高錦明

(1.陜西省漢中市略陽縣林木種苗工作站，略陽縣林業(yè)局,陜西略陽 724300；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.陜西嘉禾藥業(yè)有限公司，陜西楊凌 712100)

西南金絲梅(HypericumhenryiLevl.et fan)，又名西南金絲桃，屬藤黃科(Clusiaceae)金絲桃屬灌木，主要分布于云南中部、西部以及貴州等地區(qū)，屬于中國特有物種。西南金絲梅可用于腎炎、咽喉腫痛、風(fēng)熱感冒以及結(jié)石等疾病的治療，其全株可入藥[1-2]。隨著分離技術(shù)和檢測手段的發(fā)展，金絲桃屬植物中發(fā)現(xiàn)了越來越多結(jié)構(gòu)新穎的具有廣泛生物活性的天然產(chǎn)物[3-5]，如間苯三酚類(PPAPs)、萜類、黃酮類、香豆素類以及苯并二蒽酮類等[6-7]，使得該屬植物一度成為了天然藥物研究領(lǐng)域的熱點研究對象。Zhang等[8]從匙萼金絲桃中分離得到2個新的間苯三酚類(PPAPs)化合物-hyperuralone C和D，并對乙酰膽堿酯酶均有顯著抑制活性，其IC50值分別為9.6和7.1μmol/L。本研究中，以采自貴州省黔南布衣族苗族自治州龍里縣地區(qū)的西南金絲梅為研究對象，通過甲醇熱提，正己烷萃取，濃縮得到浸膏，并對正己烷相浸膏進行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，得到4個化合物(圖1)，其中包括1個結(jié)構(gòu)新穎的PPAPs化合物。

圖1 化合物1-4的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compound 1-4

1 材料與方法

1.1 試樣采集

西南金絲梅(HypericumhenryiLevl.et fan)采集于貴州省黔南布衣族苗族自治州龍里縣地區(qū)，采集時間是2019年8月20日。由昆明采智生物技術(shù)有限公司采集并鑒定，標(biāo)本現(xiàn)存于西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院高錦明教授研 究室。

1.2 儀器與試劑

試劑及藥品：柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；RP-C18反相硅膠和羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (美國Merck公司)。氘代氯仿、氘代DMSO、氘代甲醇(美國Merck公司)。

顯色劑：5%香草醛-硫酸-乙醇溶液(10 mL濃硫酸+90 mL乙醇，搖勻，再加5 g香草醛，即得)；10%硫酸-乙醇顯色劑(10 mL濃硫酸+ 90 mL乙醇，混勻，即得)。

儀器：Büchi Rotavapor R-101型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司)；DLSB-10/20型低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；OptiChrome-300 PLUS半制備型高速逆流色譜儀(江陰逆流科技有限公司)；Agilent 1260 型分析型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Waters 1525分析型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Bruker Avance III HD 400核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 型高分辨質(zhì)譜儀。

1.3 化合物提取分離

取干燥的西南金絲梅地面上部分10 kg，粉碎機粉碎后，用甲醇按照1∶3的料液比熱回流提取5次，每次提取時間為4 h。過濾除去殘渣，合并甲醇提取液，減壓濃縮除去甲醇溶劑后，得到浸膏1.5 kg。將浸膏用40%甲醇-水熱溶劑溶解，然后分別用正己烷萃取5次，乙酸乙酯萃取5次，最后用正丁醇萃取3次。分別合并濃縮得到正己烷相浸 280 g，乙酸乙酯相浸膏168 g，正丁醇相浸膏586 g。

用正相硅膠柱層析對正己烷相浸膏劃段，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑體系(100%正己烷→100%乙酸乙酯，體積比)梯度洗脫，利用TLC薄層檢測分析，最終得到9個組分(Fr.1～Fr.9)。餾分Fr.2(19.54 g)先經(jīng)過正相硅膠柱層析(正己烷-丙酮體系)進行分離得到9個組分 (Fr.2.1～Fr.2.9)。Fr.2.4經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯體系)和葡聚糖Sephadex LH-20凝膠柱(溶劑為氯仿∶甲醇=1∶1，體積比)分離，再經(jīng)HPLC(甲醇-水體系，99%的甲醇等度，體積比)純化得到化合物3(tR= 31.5 min, 10 mg)。Fr.2.7經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯溶劑體系)和葡聚糖Sephadex LH-20凝膠柱(溶劑為氯仿∶甲醇=1∶1，體積比)分離，再經(jīng)HPLC(甲醇-水體系，98%的甲醇等度，體積比)純化得到化合物4(tR=36 min, 10 mg)。Fr.4(25.54 g)先經(jīng)過中壓制備色譜(MPLC)(RP-18 gel, 甲醇-水體系85∶15→100∶0，體積比)，正相硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯體系)進行分離得到7個組分(Fr.4.1～Fr.4.7)。Fr.4.7經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯溶劑體系)和葡聚糖Sephadex LH-20凝膠柱(溶劑為氯仿∶甲 醇=1∶1，體積比)分離，再經(jīng)HPLC(甲醇-水體系，93%的甲醇等度，體積比)純化得到化合物1(tR=35.5 min, 5 mg)和化合物2(tR=60 min, 10 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的具有廣泛生活性的多環(huán)間苯三酚(Polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols，PPAPs)類化合物極性偏小，主要集中在正己烷相中，因此，重點分離正己烷相[7]。通過硅膠柱層析、中壓制備色譜(MPLC)、SephadexLH-20凝膠柱層析等分離技術(shù)，從西南金絲梅地上部分的正己烷浸膏中共分離出了4個化合物，并借助 NMR 和 MS等現(xiàn)代譜學(xué)知識，鑒定了化合物的結(jié)構(gòu)。

圖2 化合物1的COSY和HMBC相關(guān)信號Fig.2 Correlations of COSY and HMBC of compound 1

化合物2：無色油狀，C35H52O5，ESI-MSm/z575.37 [M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δH:4.96 (1H, m, H-32), 4.93 (1H, m, H-15), 4.88 (1H, m, H-25), 4.68 (1H, m, H-20), 4.45 (1H, s, H-1), 2.83 (1H, dd,J=15.0, 7.2 Hz, H-14a), 2.59 (1H, m, H-11), 2.55 (1H, m, H-14b), 2.49 (1H, dd,J=15.0, 7.3 Hz, H-19a), 2.09 (1H, dd,J=15.0, 7.3 Hz, H-19b), 1.96 (1H, dd,J= 13.6, 5.6 Hz, H-24a), 1.90 (2H, m, H-31), 1.73 (1H, m, H-24b), 1.72 (3H, s, H-22), 1.68 (3H, s, H-23), 1.67 (1H, m, H-6a), 1.66 (3H, s, H-27), 1.65 (3H, s, H-17), 1.655 (3H, s, H-18), 1.63 (3H, s, H-35), 1.62 (3H, s, H-34), 1.59 (3H, s, H-28), 1.50 (1H, m, H-7), 1.49 (1H, m, H-6b), 1.45 (1H, m, H-30a), 1.25 (1H, ddd,J= 15.8, 12.1, 4.3 Hz, H-30b), 1.06 (3H, s, H-29), 1.04 (3H, d,J=6.8 Hz, H-13), 1.02 (3H, d,J=6.8 Hz, H-12).13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC:207.1 (C-4), 206.4 (C-10), 197.0 (C-2), 171.9 (C-9), 138.9 (C-16), 136.4 (C-21), 134.9 (C-26), 132.5 (C-33), 122.9 (C-32), 122.6 (C-25), 117.6 (C-20), 113.6 (C-14), 95.1 (C-3), 62.6 (C-1), 56.8 (C-5), 48.4 (C-8), 42.5 (C-11), 40.0 (C-7), 38.7 (C-30), 36.6 (C-6), 29.8 (C-14), 28.9 (C-25), 27.6 (C-19), 26.1 (C-22), 25.95 (C-27), 25.9 (C-18), 25.8 (C-34), 21.7 (C-31), 19.0 (C-13), 18.9 (C-12), 18.3 (C-17), 18.2 (C-23), 18.1 (C-28), 17.9 (C-35), 16.2 (C-29)。通過查閱文獻比對[8]，確定了該化合物為hyphenrone A，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物3：無色油狀，C35H52O5，ESI-MSm/z575.37 [M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δH:5.27 (1H, m, H-21), 5.01 (1H, m, H-16), 4.97 (1H, m, H-33), 4.91 (1H, m, H-26), 3.19 (1H, dt,J=13.2, 6.6 Hz, H-11), 2.76 (1H, dd,J=15.6, 7.2 Hz, H-15a), 2.49 (1H, dd,J=15.6, 7.5 Hz, H-15b), 2.40 (2H, m, H-20), 2.25 (1H, ddd,J=18.7, 12.6, 6.0 Hz, H-32a), 2.08 (1H, dd,J=13.3, 3.4 Hz, H-25a), 1.89 (1H, dd,J=14.3, 3.6 Hz, H-6a), 1.80 (1H, m, H-32b), 1.73 (1H, m, H-31a), 1.695 (3H, s, H-23), 1.69 (3H, s, H-28), 1.66 (3H, s, H-36), 1.645 (3H, s, H-19), 1.64 (1H, m, H-25b), 1.62 (3H, s, H-18), 1.60 (1H, d,J=5.2 Hz, H-31b), 1.57 (3H, s, H-35), 1.56 (3H, s, H-24), 1.55 (3H, s, H-29), 1.28 (1H, m, H-6b), 1.09 (3H, d,J=6.6 Hz, H-13), 1.03 (1H, m, H-7), 0.99 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, d,J=6.6 Hz, H-12)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC:218.0 (C-10), 209.2 (C-4), 207.1 (C-2), 135.9 (C-17), 133.9 (C-22), 133.6 (C-27), 131.9 (C-34), 124.2 (C-33), 122.2 (C-26), 119.0 (C-21), 116.1 (C-16), 108.3 (C-9), 97.2 (C-3), 71.6 (C-1), 54.9 (C-5), 47.1 (C-8), 41.4 (C-7), 39.4 (C-11), 36.9 (C-31), 33.1 (C-6), 31.1 (C-20), 28.7 (C-25), 26.1 (C-23), 26.0 (C-24), 25.95 (C-19), 25.8 (C-36), 24.0 (C-32), 23.9 (C-15), 19.3 (C-12), 18.1 (C-29), 18.0 (C-18), 17.9 (C-24), 17.8 (C-35), 17.7 (C-13), 15.5 (C-30)。通過查閱文獻比對[9-10]，確定了該化合物為8-hydroxyhyperforin 8,1-hemiacetal，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物4：無色油狀，C30H44O5，ESI-MSm/z507.31 [M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δH:4.78 (1H, m, H-23), 4.73 (1H, m, H-28), 4.05 (1H, dt,J=13.5, 6.7 Hz, H-18), 3.64 (1H, dd,J=9.8, 4.7 Hz, H-7), 2.65 (2H, m, H-22), 2.56 (2H, m, H-27), 2.16 (1H, m, H-8a), 2.12 (1H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-11a), 1.75 (1H, m, H-12a), 1.74 (1H, m, H-11b), 1.63 (1H, m, H-12b), 1.56 (3H, s, H-31), 1.555 (3H, d,J=6.6 Hz, H-15), 1.55 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 1.545 (3H, s, H-25), 1.54 (3H, s, H-26), 1.53 (3H, s, H-30), 1.49 (1H, m, H-8b), 1.26 (3H, s, H-10), 1.13 (3H, d,J=6.8 Hz, H-19), 1.11 (3H, d,J=6.8 Hz, H-20)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC:206.8 (C-17), 196.2 (C-6), 189.7 (C-2), 175.6 (C-4), 134.4 (C-24), 133.9 (C-29), 119.3 (C-23), 118.9 (C-28), 113.0 (C-3), 106.9 (C-1), 92.6 (C-13), 86.4 (C-9), 57.6 (C-5), 42.1 (C-8), 40.9 (C-7), 38.8 (C-27), 38.5 (C-22), 37.4 (C-11), 35.5 (C-18), 32.8 (C-14), 31.5 (C-12), 26.1 (C-26), 26.0 (C-30), 19.1 (C-19), 19.0 (C-20), 18.4 (C-16), 18.2 (C-15), 18.15 (C-31), 18.1 (C-25), 17.8 (C-10)。通過查閱文獻比對[11]，確定了該化合物為hyperhenone A，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

3 結(jié)論與討論

從西南金絲梅地上部分正己烷浸膏中共分離鑒定得到4個化合物，其中化合物1和化合物2屬于有內(nèi)酯環(huán)的間苯三酚類化合物(PPAPs)[12]，化合物4屬于單環(huán)體系的間苯三酚類化合物(MPAPs)[13]，化合物3屬于一般的擁有雙環(huán)體系的間苯三酚類化合物(BPAPs)[14]，其中化合物1為一個新化合物，命名為hyphenrone Y，化合物2-4分別為已知的化合物hyphenrone A， 8-hydroxyhyperforin 8,1-hemiacetal和hyperhenone A?；衔?-4在抗神經(jīng)炎活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗中均未呈現(xiàn)明顯的活性。根據(jù)文獻報道，已知化合物hyphenrone A具有潛在的抗腫瘤活性[2, 10]，hyphenrone Y與hyphenrone A結(jié)構(gòu)十分相似，可以在后續(xù)對其抗腫瘤活性進行研究。