肺癌組織樣本和血液樣本EGFR基因檢測對比研究

鄧會巖，劉 暢，賈 迎，李 芳，尹丹靜，檀紫瑞，蘇 冰，劉月平，*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北省寧晉縣婦幼保健院，河北 邢臺 055550)

目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)的腫瘤疾病中居首位，且發(fā)病率仍有逐年上升的趨勢，我國亦不例外，全球癌癥數(shù)據(jù)表明，肺癌導(dǎo)致的死亡占總體癌癥死亡人數(shù)的18.0%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，大多數(shù)NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時即為晚期或已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。近年來，肺腺癌發(fā)病率已超過鱗狀細(xì)胞癌[3]。放化療是最常用于局部晚期或晚期NSCLC 的治療方法，它可以一定程度地改善癥狀、延長生存期，但存在腫瘤進(jìn)展快、藥物副作用大等缺點(diǎn)。隨著目前分子檢測技術(shù)的廣泛開展，腫瘤的分子生物學(xué)檢測和靶向治療為患者提供了新的治療策略。

NSCLC 中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變的發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)了一種新的治療模式[4]。針對有EGFR基因突變的肺腺癌患者，診斷、治療和臨床預(yù)后有別于非EGFR基因突變的患者，EGFR基因突變患者進(jìn)行酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)治療，對于延長患者生存期及改善患者生存質(zhì)量都具有顯著的指導(dǎo)意義[5]。組織活檢是進(jìn)行EGFR基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)一步提供有關(guān)腫瘤遺傳特征的信息，有助于確定可接受治療的患者[6]。然而，臨床上組織樣本取材困難，二次取材活檢更是無法實(shí)現(xiàn)[7]。此時，外周血及胸水是一種存在于實(shí)性腫瘤組織外，可用于EGFR基因檢測的腫瘤成分。外周血循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)可提供與侵入性腫瘤活檢組織相似的分子遺傳信息，通常被稱為“液體活檢”，可用于療效監(jiān)測、早期輔助診斷及腫瘤進(jìn)展與不良預(yù)后的早期預(yù)警[8]。除此之外，聯(lián)合胸水及胸水沉渣細(xì)胞檢測已成為檢測NSCLC 患者EGFR突變的幾種新的、有前景且侵入性較小的補(bǔ)充方式，均是目前臨床常用的檢測手段。

本研究回顧分析收治的175 例肺腺癌患者，均為Ⅲ和Ⅳ期患者病例，所有病例均通過突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法進(jìn)行了EGFR基因突變檢測，并對比不同樣本間的檢測結(jié)果。為進(jìn)一步提升肺腺癌患者的EGFR突變檢出率，更多地篩選出適合靶向治療的患者提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年7月—2017年12月在河北省腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科和腫瘤內(nèi)科收治的Ⅲ~Ⅳ期肺腺癌住院和門診病例175 例，本研究所有病例均取得患者知情同意及通過倫理審查(2020KY314)。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為肺腺癌(131例患者經(jīng)組織病理證實(shí)為肺腺癌，其中119 例患者經(jīng)組織活檢樣本證實(shí)，12 例患者經(jīng)胸水沉渣細(xì)胞樣本證實(shí)，44例患者經(jīng)氣管鏡刷片細(xì)胞病理證實(shí))。175 例均有血漿樣本，其中119 例同時有活檢組織樣本，12例同時有胸水沉渣細(xì)胞樣本。男48例，女127 例，年齡39~82 歲，平均年齡63 歲，中位年齡54歲。臨床分期Ⅲ期74例，Ⅳ期101例。

1.2 試劑與儀器

核酸提取試劑盒、EGFR基因突變檢測試劑盒和熒光定量PCR儀均購于美國羅氏公司。其他主要儀器包括賽默飛Biofuge Primor 低溫離心機(jī)，蔡司Scope A.1光學(xué)顯微鏡。

1.3 血漿標(biāo)本采集與血漿游離DNA提取、擴(kuò)增

經(jīng)靜脈采集患者外周血液5 mL，置入EDTA抗凝離心管，按照核酸提取試劑盒操作說明提取游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)，提取完畢后測定DNA 濃度，并以此cfDNA 為模板，按EGFR基因突變檢測試劑盒說明書進(jìn)行EGFR基因19~21外顯子突變檢測。

1.4 肺癌組織標(biāo)本DNA提取與擴(kuò)增

肺癌活檢組織樣本和胸水沉渣細(xì)胞樣本均進(jìn)行福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffinembedding，F(xiàn)FPE)，經(jīng)診斷確診后，將FFPE 組織按照5 μm 厚度連續(xù)切片10張，并將切取的組織片置于1.5 mL有蓋無菌微量離心管中，按照核酸提取試劑盒操作說明提取DNA(脫蠟、消化裂解、吸附核酸、洗滌純化、洗脫DNA)，提取完畢后測定DNA 濃度，并以肺癌組織樣本基因組DNA為模板，后續(xù)提取與擴(kuò)增過程同步驟1.3。

1.5 胸水沉渣細(xì)胞樣本DNA提取與擴(kuò)增

胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)病理證實(shí)為腺癌的患者，另取積液1.5 mL 置于有蓋無菌微量離心管中，室溫10 000 r/min 離心3 min，棄上清。向沉淀中加入1 mL 1×PBS混勻后室溫10 000 r/min離心3 min，棄上清，獲得最終細(xì)胞沉淀，并制作成FFPE 樣本塊，后續(xù)提取與擴(kuò)增過程同步驟1.4。若收集的細(xì)胞沉淀中有大量的紅細(xì)胞殘留，可加紅細(xì)胞裂解液混勻后，室溫放置5 min，10 000 r/min 離心3 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，可重復(fù)幾次直至紅細(xì)胞去除干凈。

1.6 隨 訪

所有患者進(jìn)行電話方式隨訪，隨訪截至2018 年5月31 日，失聯(lián)病例計(jì)為失訪，共73 例失訪病例?？偵鏁r間為從確診到死亡或末次隨訪時間，以月為單位。中位隨訪時間13個月。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，患者不同臨床病理指標(biāo)組患者血液EGFR突變率的差異采用卡方檢驗(yàn)，血液樣本和組織樣本EGFR突變率的比較采用Fisher精確概率法，將卡方檢驗(yàn)中與EGFR突變相關(guān)的諸因素納入Cox 回歸進(jìn)行患者臨床病理指標(biāo)與生存時間之間的多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC患者臨床病理特征

175 例患者均為晚期肺癌患者，均進(jìn)行ctDNAEGFR突變檢測，檢測成功率為100%(175/175)。119例患者同時進(jìn)行組織活檢樣本EGFR基因檢測，12 例患者同時進(jìn)行胸水沉渣細(xì)胞樣本EGFR基因檢測，但樣本檢測成功率為96.9%(127/131)，失敗樣本均為胸水沉渣細(xì)胞樣本，其中1 例為樣本DNA 質(zhì)量差，3 例為提取樣本DNA濃度<2 ng/μL，低于上樣濃度。不管是血液樣本還是組織樣本，EGFR突變均以Exon19 del 和Exon21 L858R 為主，兩者突變率的總和分別占血液樣本和組織樣本總突變率的83.0%和81.7%，不同樣本間EGFR突變分布見表1。48 例無組織樣本或組織樣本檢測不成功的患者中，其中10 例血液樣本EGFR檢測為陽性。在175 例晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，59/175 例(33.7%)存在血液樣本EGFR檢測陽性，60/127 例(47.2%)存在組織樣本EGFR突變陽性。晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR突變在不同的性別(χ2=3.451，P=0.045)、 腫 瘤 直 徑 (χ2=8.911，P=0.002)、 T 分 期 (χ2=17.567，P=0.000)、 淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移 (χ2=18.511，P=0.000)、轉(zhuǎn)移站數(shù)(χ2=3.341，P=0.047)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=10.874，P=0.001)的分組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各臨床病理指標(biāo)與EGFR突變之間的關(guān)系見表2。

表1 不同樣本間EGFR突變分布[百分率(各位點(diǎn)陽性例數(shù)/總陽性例數(shù))]

表2 175例肺腺癌患者臨床病理特征及與血液樣本EGFR突變關(guān)系

2.2 血液樣本與組織樣本EGFR突變對比分析

127 例患者同時進(jìn)行了肺癌血液樣本和組織樣本EGFR檢測，通過表1中對比血液樣本和組織樣本檢測EGFR突變狀態(tài)總體一致性為85.0%(108/127)，即45例患者血漿EGFR檢測與組織樣本EGFR檢測結(jié)果均為EGFR檢測陽性；而63 例患者兩種樣本EGFR檢測均為陰性。4 例患者僅在血液EGFR檢測中為陽性；15例患者僅在組織樣本EGFR檢測中為陽性。未經(jīng)組織檢測或組織檢測不成功的48 例患者中，經(jīng)血液EGFR檢測，10 例患者為陽性，其余均為陰性。采用Fisher精確概率法將血液和組織兩組樣本EGFR突變率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。各組間的突變率見表3。

表3 血液樣本和組織樣本EGFR突變率對比

2.3 生存分析

血漿DNA 中存在EGFR檢測陽性的患者，其無進(jìn)展生存期比陰性的患者更長。EGFR檢測陽性患者中位無進(jìn)展生存期為5.7個月，而EGFR檢測陰性患者中位無進(jìn)展生存期為 2.8 個月(χ2=8.943，P<0.05)。在患者臨床病理指標(biāo)與生存時間的分析中，腫瘤直徑[95%CI(0.151， 0.725)，P=0.006]、 淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移 [95%CI(0.180， 0.865)，P=0.020]、 遠(yuǎn) 處 轉(zhuǎn) 移 [95%CI(0.097，0.612)，P=0.003]均是影響患者無進(jìn)展生存期的重要因素。各組間的生存期分析見表4。

表4 患者臨床病理指標(biāo)與生存時間的多因素分析結(jié)果

3 討 論

EGFR信號通路作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的通路之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、活化、凋亡等多種生物學(xué)事件中起到關(guān)鍵作用。異常的EGFR基因活化，可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移，甚至新生血管生成[9]。我國晚期肺腺癌EGFR基因陽性率在40%~60%之間，在當(dāng)今精準(zhǔn)化醫(yī)療的時代，EGFR突變陽性對于晚期肺癌患者來說意義重大。目前，此類患者可采用基于EGFR基因的靶向藥物如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gifitinib)和奧沙替尼(osimertinib)進(jìn)行治療。但靶向藥物的應(yīng)用、療效以及是否存在耐藥均需要通過評估EGFR基因突變狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)。因此，如何選取檢測樣本，以及如何采用靈敏度高、準(zhǔn)確性好的檢測方法將此類患者檢測出基因變異，從而篩選出可用藥患者是當(dāng)今精準(zhǔn)治療的重中之重。

研究顯示[10]，大部分晚期NSCLC 患者的血液中存在循環(huán)游離DNA(cell free DNA，cfDNA)。cfDNA主要來源于凋亡或壞死的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，如果來自腫瘤細(xì)胞稱為ctDNA。血液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低，平均約為17 μg/L。既往系列研究已經(jīng)在NSCLC 患者的血漿或血清樣本ctDNA 中發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變，初步顯示外周血ctDNAEGFR基因突變檢測及對EGFR-TKIs療效預(yù)測的可行性[10-11]。此外，NSCLC 患者在TKI 治療過程中會發(fā)生耐藥，甚至有文獻(xiàn)報道過多次藥物敏感、耐藥交替出現(xiàn)[10-11]。因此，在腫瘤不同時期、治療的不同階段利用便捷的血液EGFR基因檢測，動態(tài)監(jiān)測EGFR突變狀態(tài)，調(diào)整治療方案，合適的時間將合適藥物用在合適的患者身上，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。

國內(nèi)部分專家曾就檢測EGFR基因突變的規(guī)范提出了建議[12]。建議指出肺癌組織樣本如手術(shù)標(biāo)本、活檢標(biāo)本、胸水沉渣細(xì)胞標(biāo)本和血液標(biāo)本均是晚期NSCLCEGFR突變狀態(tài)檢測可選擇的樣本[13-14]。本研究比較了血液樣本和肺癌組織樣本EGFR基因突變的異同，結(jié)果顯示了肺癌組織樣本和血液樣本的EGFR基因檢測結(jié)果存在小部分病例間的差異，且肺癌組織樣本的陽性率高于血液，以及存在單純血液樣本EGFR為突變型而肺癌組織樣本為野生型的病例，這些差異可能反映了血液DNA檢測技術(shù)的局限性和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，同樣也可能預(yù)示了對化療/靶向治療的敏感性差異。但盡管這種異質(zhì)性在許多癌癥尤其是在非小細(xì)胞肺癌中是已知的，但一個臨床決定通常僅基于一次活檢，由于血液反映了整個連續(xù)的腫瘤負(fù)荷，因此，使用血漿DNA 進(jìn)行EGFR突變檢測可能更為準(zhǔn)確并且信息量大。在肺癌組織樣本中，除了納入活檢組織樣本，本研究還納入了胸水沉渣細(xì)胞樣本，此類樣本在臨床工作中同樣為常見樣本，本組12例胸水沉渣樣本EGFR突變率為37.5%，雖然陽性率略低于活檢組織樣本和血液樣本，但是無疑是一種行之有效的檢測手段，在活檢組織樣本取材困難且存在大量癌性胸水的病例中，采用胸水沉渣細(xì)胞進(jìn)行EGFR基因檢測是一種很好的檢測方法。此類樣本除滿足臨床診斷的需求外，在進(jìn)行EGFR基因檢測時同樣會面臨樣本量不足、處理不良導(dǎo)致DNA 降解等問題，本組12 例胸水沉渣樣本中4 例檢測失敗，其中1 例為樣本DNA 質(zhì)量差，3 例為提取樣本DNA 濃度低于上樣濃度，此類問題雖然在本組研究中均出現(xiàn)在胸水沉渣樣本中，但在其他樣本中同樣常見，應(yīng)盡可能地避免此類問題的出現(xiàn)，進(jìn)而提升EGFR突變檢出率。

眾所周知，在TKIs治療的患者中，在預(yù)處理標(biāo)本中不能檢測到的引起TKI 抗性的突變可能會在患者中復(fù)發(fā)，如T790M突變，T790M突變是EGFR-TKIs治療過程中最常見的耐藥突變。AURA 研究顯示，osimertinib 對血漿中T790M 陽性和在活檢組織中T790M陰性患者的療效低于T790M組織檢測陽性的患者。目前的臨床實(shí)踐表明[15]，由于T790M 在腫瘤組織中存在異質(zhì)性，因此需要在復(fù)發(fā)部位進(jìn)行再次活檢以預(yù)測osimertinib 的治療效果?？傊簶?biāo)本和組織標(biāo)本互為補(bǔ)充，在組織標(biāo)本EGFR檢測為野生型時，或者無法獲得組織樣本時，均有必要對血液標(biāo)本進(jìn)行EGFR檢測，以提高EGFR基因的檢出率，擴(kuò)大TKIs適用人群。

Thress 等[16]報道，胸外轉(zhuǎn)移性患者比胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移患者的血漿中更容易檢測到EGFR基因突變，且EGFR陽性組出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯高于陰性組。這表明腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)可能影響血漿中EGFR是否突變，需在臨床工作中進(jìn)一步驗(yàn)證，此研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致，且除了腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移等，女性患者、腫瘤直徑≥3 cm等也均是影響血液EGFR基因突變檢出率的重要因素。

本研究應(yīng)用肺癌組織樣本檢測和血液樣本檢測的方法進(jìn)一步證實(shí)了血漿中EGFR突變檢測的可行性，但基于樣本量小，有待收集更多的病例闡明血漿樣本可以和腫瘤組織樣本EGFR檢測中發(fā)揮同等效用，甚至是在將來可以代替活檢組織樣本檢測EGFR突變。此外，血漿EGFR動態(tài)監(jiān)測可以幫助臨床醫(yī)生為患者選擇最佳治療時機(jī)，不同樣本同時進(jìn)行檢測有助于提高檢出率，擴(kuò)大受益人群。