腫瘤干細胞培養(yǎng)與分選鑒定的研究進展

郭德志，張建鵬

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員三大隊八隊，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433)

近10 年來惡性腫瘤的發(fā)病率保持每年約3.9%的增幅，死亡率保持每年2.5%的增幅，引起了人們的高度重視[1]。對于多數(shù)惡性腫瘤而言，外科治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療以及免疫治療等方法可以殺死患者體內(nèi)的大部分腫瘤細胞，卻難以從根本上治愈癌癥。這一現(xiàn)象可以用腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論加以解釋。CSCs 具有自我更新、無限增殖和抗化學(xué)毒物損傷的能力，與腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著極為密切的關(guān)系。CSCs有5個獨立的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，包括自我更新能力，占總腫瘤種群的小部分，可復(fù)制的腫瘤表型，向非致瘤細胞的多潛能分化能力，以及獨特的細胞表面抗原表型[2]。近年來，CSCs 在各種腫瘤中不斷被發(fā)現(xiàn)，例如前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等。對CSCs 的研究和靶向療法的嘗試，均印證了該學(xué)說[3-7]。如果能從腫瘤細胞中分離、培養(yǎng)CSCs，建立可靠的腫瘤模型，則有助于揭示CSCs 的功能特性和腫瘤發(fā)生機制，進而靶向消除干細胞樣腫瘤細胞群，將有望成為治療惡性腫瘤的有效策略之一。因此，本文主要對CSCs的常用培養(yǎng)和分選鑒定方法及其原理進行綜述，并對各類方法進行總結(jié)和對比。

1 CSCs的培養(yǎng)方法

1.1 非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)

非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)是將細胞系培養(yǎng)在具有非黏附表面的培養(yǎng)塑料制品中。一般采用在培養(yǎng)皿上涂覆瓊脂糖薄膜的方式使細胞懸浮，或者采用胰酶解離貼壁細胞后再種植在DMEM培養(yǎng)基上的方法[8]。通常非黏附條件下生長的細胞球失去錨固，黏附分子通過信號傳遞途徑影響細胞凋亡相關(guān)基因，較易導(dǎo)致凋亡反應(yīng)。而對于CSCs 細胞，當(dāng)細胞球體處于惡劣環(huán)境時可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，激發(fā)其表達相關(guān)特性的潛力，從而得到富集培養(yǎng)的細胞球。相比于需要2~6 周的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)5~7 d 內(nèi)可生成球體，具有良好的時效性；并且這種改良的非黏附性培養(yǎng)系統(tǒng)不需要添加生長因子，成本效益高[9]；同時，相比于貼壁的細胞，腫瘤細胞球的集落形成能力、自我更新能力、細胞侵襲力、化療耐藥性和可能的干細胞標(biāo)志物的表達均顯著增加[8，10]。

1.2 三維(3D)培養(yǎng)系統(tǒng)

非干細胞樣癌細胞似乎可自發(fā)地重新轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉毎麡影┘毎鸞11]。研究表明，來自人結(jié)腸癌患者的小部分無干細胞標(biāo)志物的細胞亞群可表現(xiàn)出非隨機的自我更新能力和致瘤性[12]。因此，基于CSCs標(biāo)志物的培養(yǎng)方法并不可靠[13]。

目前，培養(yǎng)扁平單層細胞的二維(2D)平臺仍然是細胞測定研究最常用的培養(yǎng)方法。2D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)簡單、方便、經(jīng)濟高效且應(yīng)用廣泛。但是，傳統(tǒng)2D 培養(yǎng)的局限性無法模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)，與真實微環(huán)境差別較大的2D 環(huán)境可能在癌細胞對抗癌藥物的預(yù)測實驗中造成誤導(dǎo)性結(jié)果[14]。原因在于實體腫瘤以3D構(gòu)象生長，即實體腫瘤周圍環(huán)繞著各種非腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。在這些條件下，腫瘤細胞往往暴露于次優(yōu)生長條件下，如缺氧或低營養(yǎng)水平，并受到細胞間接觸抑制或來自周圍腫瘤和非腫瘤細胞的各種信號的影響[15]。因此，3D培養(yǎng)系統(tǒng)在研究癌細胞的生長、增殖、分化、轉(zhuǎn)移及腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)等方面顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[16]。于是出現(xiàn)了用軟三維(3D)纖維蛋白凝膠選擇和培養(yǎng)CSCs的機械方法。研究顯示，機械力可以調(diào)節(jié)胚胎干細胞的分化和自我更新，腫瘤細胞的分化能力也與培養(yǎng)基質(zhì)的剛性有關(guān)[17-18]。因此，使用軟基質(zhì)的機械策略可從癌細胞選擇CSCs。3D 培養(yǎng)系統(tǒng)比單層培養(yǎng)物更有效地模擬組織樣結(jié)構(gòu)，在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及卵巢癌中均已被應(yīng)用[19-20]。3D培養(yǎng)系統(tǒng)包括多細胞球體形成(液體覆蓋培養(yǎng)和懸掛液滴法)、水凝膠培養(yǎng)、生物反應(yīng)器培養(yǎng)、生物打印和支架培養(yǎng)。雖然每種3D培養(yǎng)的技術(shù)和方案不同，但其目的均盡可能模擬細胞在真實情況下的微環(huán)境。

相比于傳統(tǒng)的2D 纖維蛋白底物，3D 軟纖維蛋白凝膠具有“激發(fā)效應(yīng)”，使培養(yǎng)出的細胞表現(xiàn)出更高的致瘤性，例如在阿霉素或順鉑培養(yǎng)條件下不易凋亡；能培育出體積相對較大的球狀體并更快地生長；將腫瘤細胞球接種到小鼠體內(nèi)，表現(xiàn)出更高的致瘤能力，細胞球能在惡劣環(huán)境中存活并且大多數(shù)最終長成大腫瘤。而且相比于根據(jù)標(biāo)志物分選出的CD133+、CD44+細胞，該方法培養(yǎng)出的細胞更易形成腫瘤?？傊?，3D軟纖維蛋白凝膠憑借其相對于癌細胞剛度的柔軟性，可以控制癌細胞亞群的分化行為和增殖速度，因此這種方法多用于培養(yǎng)、選擇目標(biāo)細胞系中，且此方法不依賴于干細胞標(biāo)志物[13]。

1.2.1 支架培養(yǎng)3D 支架通常是由多種材料構(gòu)成的天然或合成3D 結(jié)構(gòu)，不同支架具有不同的孔隙率、滲透率、表面化學(xué)和機械特性，會對細胞培養(yǎng)造成不同的影響。它們主要用于模仿某種特定細胞類型在特定組織的體內(nèi)微環(huán)境。因此，天然或合成的水凝膠是支架的理想材料[21]。但水凝膠一般價格昂貴，另一種選擇則是與其他支架產(chǎn)品一起使用，比如合成的納米纖維材料[22]。有研究表明，間距為50 μm、孔隙率為1∶2的單層支架效果最佳[23]。需要注意的是，支架培養(yǎng)的三維模型構(gòu)建需要較高成本，且不同批次的三維支架重復(fù)性低[19]。

1.2.2 懸滴技術(shù)懸掛液滴(簡稱懸滴)技術(shù)相對簡單且適用于許多細胞系，幾乎每個液滴均可以生成一個3D 球體。懸滴技術(shù)最初在培養(yǎng)皿蓋中進行，方法是將少量具有特定細胞密度的細胞懸浮液(15~30 μL)滴落到蓋子上，隨后倒置，由于表面張力而將等分試樣的細胞懸浮液變成懸掛滴劑而不會滴落。因此，細胞被迫積聚在液滴的底部，液-空氣界面處，并進一步聚集和增殖，直到形成球體[14]。后來，有了代替培養(yǎng)皿板的懸掛式滴板。由于滴板與液體處理器系統(tǒng)、高通量加樣設(shè)備均能兼容，使其操作起來更加簡單，且每塊板可以生產(chǎn)更多的3D球體，但價格昂貴[21]。

1.2.3 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器3D 培養(yǎng)系統(tǒng)的一般原理是，通過輕輕攪拌，旋轉(zhuǎn)腔室或使用泵系統(tǒng)通過支架灌注培養(yǎng)基，將具有最佳細胞密度的細胞懸浮液通過連續(xù)攪拌填充到腔室中。生物反應(yīng)器配有介質(zhì)流動系統(tǒng)，以提供營養(yǎng)循環(huán)，排出代謝廢物，且生物反應(yīng)器內(nèi)物理和化學(xué)因素具有均勻性[14]。因此，基于生物反應(yīng)器的細胞培養(yǎng)模型適用于密集的細胞擴增和大規(guī)模生物分子生產(chǎn)，例如抗體或生長因子。該方法的優(yōu)點在于能夠精確和可重復(fù)地控制細胞培養(yǎng)所需的許多環(huán)境條件，能夠在生長過程中維持和監(jiān)測環(huán)境[19，24]。

培養(yǎng)CSCs 的要點是需基于其生長特性進行培養(yǎng)的；關(guān)鍵點在于如何模擬TME；難點在于如何建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件，如何防止CSCs 的分化；而如何讓培養(yǎng)方法操作簡單、成功率高、便于推廣，需要更進一步探究。值得注意的是，上文只是闡述了CSCs 的培養(yǎng)方法，不同來源的腫瘤特性不同，培養(yǎng)條件也不完全相同，在實際操作中需要經(jīng)過摸索才能針對不同的CSCs建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。

2 CSCs分選鑒定方法

鑒定方法通常為免疫組化染色、RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 反 應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)以及體內(nèi)致瘤性研究。除此之外，還有Western blot、化學(xué)敏感性和放射敏感性測定、血細胞比容分析、cDNA 微陣列分析等方式。在目前的研究中，CSCs的分離鑒定并不是采用單一的方法，而是選用多種方法聯(lián)合以獲得純度更高的CSCs。

2.1 側(cè)群細胞分選法

側(cè)群細胞(side population，SP)又稱邊緣細胞，其特點是可以將進入細胞核的熒光染料Hoechst33342排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀檢測時表現(xiàn)為不著色。這類細胞是1996 年Goodell 等在用Hoechst33342 染色法研究骨髓時發(fā)現(xiàn)的，他們將其命名為SP 細胞。而隨著對SP 細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)SP細胞可發(fā)生不對稱分裂、具有自我更新等功能[25]，這些特性與CSCs一致，所以通過分選SP細胞，可達到富集CSCs的效果。目前已證實在多種腫瘤細胞系中存在SP細胞，例如在上皮性卵巢癌細胞系中SP 細胞占比0.5%，人結(jié)腸直腸癌組織中SP 細胞的比例為0.90%，胃癌BGC-823 細胞株中的SP 細胞約占2%，大腸癌細胞系Lovo中約含0.54%~0.62%[26-29]。

一種方法是應(yīng)用無血清培養(yǎng)液(serum-free media，SFM)分離SP 細胞：①將需要培養(yǎng)SP 細胞的細胞系在傳統(tǒng)血清培養(yǎng)基(serum-supplemented media，SSM)中傳代；②選擇對數(shù)生長期的細胞，清洗后經(jīng)胰酶消化并計數(shù)，重懸于SFM中，接種于孔板繼續(xù)培養(yǎng)；③待增殖形成細胞球3~4 d 后，再進行重懸傳代。如此反復(fù)，在SSM和SFM培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)，其中能形成致密形態(tài)一致的腫瘤球且傳代后腫瘤球的總數(shù)大量擴增的這部分腫瘤球細胞，即為SP細胞[29]。

根據(jù)SP細胞能夠?qū)晒馊玖螲oechst33342泵出細胞外而使細胞呈弱熒光信號這一特性，還可以使用流式細胞分選技術(shù)分選SP細胞[30]。進行2~3次分選，分析SP細胞比例變化，直至能夠獲得穩(wěn)定比例的SP細胞[26]。此方法優(yōu)點是操作簡便，但是分離效率低，且染料有一定的細胞毒性，影響細胞活性。

SP 細胞分選法主要用于富集耐藥性強的CSCs，因此，在研究新型藥物對CSCs 的殺傷效果時，常用此方法富集細胞。例如，研究肉桂醛對胰腺癌細胞的作用，研究靈芝烯酸B對胃癌細胞的作用以及槐耳對肝癌細胞的作用等均采用的SP細胞分選法[30-32]。但需要注意的是，SP 細胞并不一定等同于CSCs 本身[33-34]。對于不同類型的腫瘤，SP 細胞分選培養(yǎng)法能否適用，仍需要進一步研究。

2.2 藥物選擇分離

根據(jù)CSCs 假說，CSCs 的基本特性是對化療具有抗性。由于這種特征，CSCs 可以在治療過程中存活并再生腫瘤。因此，使用特定藥物例如紫杉醇和順鉑培養(yǎng)細胞，輔以表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、白血病抑制因子、胰島素或標(biāo)準(zhǔn)含血清系統(tǒng)，在藥物選擇和無血清培養(yǎng)系統(tǒng)下形成的非貼壁細胞球，對順鉑、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤的耐藥性更強[35]。

具體方法為：先在無順鉑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)對數(shù)生長期的細胞，傳代后依次遞增順鉑濃度誘導(dǎo)細胞耐藥，最后得到穩(wěn)定生長且可傳代的耐藥細胞即為干細胞[36]?？上韧ㄟ^細胞增殖實驗CCK-8 或MTS 法計算藥物抑制率IC50，進行初步檢驗，再通過實時熒光定量PCR、流式細胞術(shù)和Western blot 等方法，檢測腫瘤干性相關(guān)基因的表達水平，對篩選獲得細胞的干性進行驗證[36]。結(jié)果表明，在低濃度或高濃度下應(yīng)用連續(xù)或多步驟藥物選擇建立的多藥耐藥癌細胞系，即使在體外長期培養(yǎng)，或在不同條件下培養(yǎng)數(shù)年甚至數(shù)十年，其腫瘤細胞培養(yǎng)物中仍然擁有少量致瘤細胞，這進一步證明了其具有干性[37]。

2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR

通常利用商品化的試劑盒提取RNA，實時熒光定量PCR是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對樣本進行定量分析，用于分析mRNA的PCR引物可以是GAPDH，或者其他保守序列。MYC、OCT4、SOX2、Nanog 幾乎在各類CSCs 中均呈現(xiàn)過表達，可作為分析基因[38]。用該方法分析的基因最好是：①包括CSCs分子標(biāo)記和調(diào)節(jié)CSCs 增殖，自我更新和多能性的基因，以幫助確保CSCs分離株在培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性；②包括參與CSCs 不對稱細胞分裂、遷移和轉(zhuǎn)移的基因，以及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以幫助促進CSCs表征以及目前正在測試的治療劑的靶標(biāo)。

2.4 流式細胞術(shù)

與正常癌細胞不同，CSCs 具有獨特的細胞特征。其中，CD133、CD44 和上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)等是常用且適用于大多數(shù)CSCs 鑒定的非特異性標(biāo)志物[34]。乳腺癌干細胞的特異性標(biāo)志物主要為CD29 和CD90 等；肝癌干細胞的特異性標(biāo)志物是CD90 和CD13；頭頸部鱗狀細胞癌的干細胞標(biāo)志物為CD271；子宮內(nèi)膜癌的干細胞標(biāo)志物CD117；胰腺癌CSCs的特殊標(biāo)記物為CD24[39-43]。根據(jù)特定的標(biāo)記，流式細胞術(shù)可對細胞表面標(biāo)志物陽性和陰性的腫瘤細胞進行分選。因為CSCs 在腫瘤細胞中相當(dāng)稀少，所以該分選方式需要獲得大量備選的腫瘤細胞。在分選陽性比例很低的CSCs時，還經(jīng)常聯(lián)合使用陽性分選和陰性分選，以得到高純度的CSCs。此外，氧含量影響干細胞標(biāo)志物的表達，胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)物也可能影響CD133+細胞的表達，因此，需要考慮實驗程序是否可能會影響后續(xù)研究及CSCs的產(chǎn)量[44]。

2.4.1 熒光激活細胞分選熒光激活細胞分選(fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS)是一種成熟的方法。首先將熒光標(biāo)記的抗體與CSCs 表面的標(biāo)記結(jié)合，再將細胞以流注的形式通過細胞分選器。在出口，熒光被激光所激發(fā)，發(fā)射的熒光信號通過光電倍增管放大，帶有不同熒光標(biāo)記的細胞被分離，即可分選出CSCs[34]。

FACS 的優(yōu)勢在于多個標(biāo)記可以同時排序，并且具有高特異性。同時，F(xiàn)ACS 可檢測的特征不僅局限于表觀特征，而且可檢測細胞信號通路的活性和蛋白質(zhì)的相互作用，這很好的解決了實體瘤干細胞缺乏膜抗原的問題。但FACS 設(shè)備價格昂貴且對無菌條件的要求很高，因此，建議在培養(yǎng)基中加入青霉素和鏈霉素。另外，噴嘴尺寸會影響分選的速度，應(yīng)選取CSCs直徑4~5倍即85~100 μm的噴嘴；為避免分選時間過長導(dǎo)致細胞活力降低，細胞應(yīng)以每毫升1×107~2×107個的濃度重懸[44]。

2.4.2 磁激活細胞分選磁激活細胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)是一種簡單高效的方法。在能與表面標(biāo)記結(jié)合的抗體上附加磁珠，當(dāng)腫瘤細胞通過置于磁場中的分離柱時，與磁珠結(jié)合的細胞通過磁力被保留在分離柱的內(nèi)表面，未結(jié)合的細胞則通過分離柱。隨后，可以從柱中洗脫表面標(biāo)記陽性細胞。

由于磁珠由氧化鐵和多糖涂層制成，且體積微小隨時間會被去除，其對細胞活力的影響很小，因此該方法適合大量細胞分選。盡管如此，該方法的應(yīng)用依舊受到限制：一是分選前的處理比較耗時；二是分選設(shè)備和磁珠價格昂貴，磁珠不能重復(fù)使用；三是該方法每次分選只能依賴于單個膜抗原，而實體瘤干細胞卻常常缺乏膜抗原的表達[44]。

2.5 Western blot檢測

該方法作為傳統(tǒng)的分選鑒定方法，簡單方便且普適性高，基本適用于所有類型的CSCs。同時，其高度的靈敏性降低了實驗成本。但是，如果操作不當(dāng)，容易造成產(chǎn)生多個譜帶、褪色等問題，得到假陽性或假陰性反應(yīng)。該方法可作為驗證實驗分析鑒定分選結(jié)果。

3 小 結(jié)

由于CSCs 的定義還不夠明確，只能根據(jù)其特性對CSCs 加以判斷，目前仍無標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法，因此需要多種方法配合使用才能得到相對理想的干細胞。同時，選擇分離方法時，需要從研究目的、實驗成本和實驗流程等角度來考量。此外，通過上述總結(jié)，不難發(fā)現(xiàn)CSCs 的培養(yǎng)和鑒定方法在過去的研究中有了顯著進步，但仍舊存在許多問題：懸浮培養(yǎng)法導(dǎo)致細胞粘貼在一起，難以獲得單克隆細胞；培養(yǎng)周期長，導(dǎo)致細胞失去干性；標(biāo)記SP群的染料有毒，影響細胞活力。從經(jīng)濟的角度考慮，那些高效的方法成本往往較高。從臨床的角度考慮，為了在手術(shù)中可視化CSCs，也需要尋找更特異、無毒的CSCs 染料。同時，需要制定用于分離和富集CSCs 的標(biāo)準(zhǔn)化方案。最后，在此基礎(chǔ)上，需要對干細胞標(biāo)志物和相關(guān)通路進行進一步的探索。比如，在研究中發(fā)現(xiàn)有些培養(yǎng)方式下的干細胞會表達Sox2，這可能對CSCs在體內(nèi)的自我更新和生長至關(guān)重要。還有一些標(biāo)志物是異常信號通路的一部分，會導(dǎo)致腫瘤細胞對化療產(chǎn)生耐藥性。這些研究可以促使靶向藥物的研發(fā)，從而解決臨床腫瘤的耐藥復(fù)發(fā)等問題。