二甲雙胍對(duì)鎘誘導(dǎo)小鼠急性肝毒性的影響

譚明雪，柳曉玲，姜姝蕓，潘心紅，陳 雯，陳麗萍，*

(1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.廣州市疾病預(yù)防與控制中心毒理科，廣東 廣州 510440)

鎘是廣泛存在的環(huán)境污染物和內(nèi)分泌干擾物，鎘元素一般天然存在于地殼表面，常見工業(yè)活動(dòng)如采礦、制造鎳鎘電池和電子產(chǎn)品等會(huì)讓鎘元素以污染物的形式釋放出來(lái)，流入自然環(huán)境中。鎘可以通過(guò)空氣、水進(jìn)入到人體內(nèi)[1-2]。流行病學(xué)研究顯示環(huán)境鎘暴露會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，比如高血壓、Ⅱ型糖尿病、腎功能衰竭和肝臟疾病等[3-4]，特別是肝臟疾病，人群調(diào)查顯示壞死性肝炎和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率與環(huán)境鎘暴露相關(guān)[5]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示鎘具有明顯的肝臟毒性[6]，因此尋找其防治藥物具有重要的公共衛(wèi)生意義。以往的實(shí)驗(yàn)性研究發(fā)現(xiàn)植物糖蛋白[7]和腐胺[8]等能在一定程度上緩解鎘相關(guān)的肝臟疾病，但是否能正式用于臨床治療仍有待研究，因此“老藥新用”可能更具有應(yīng)用前景。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是真核生物中最主要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶，調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、DNA損傷修復(fù)等事件[9]，其活性降低和很多人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。以往研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞PPP2R1A基因(編碼PP2A Aα亞基)敲除小鼠出現(xiàn)了肝脂質(zhì)變性、炎癥和肝纖維化的表型[11]，表明PP2A在調(diào)控肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PP2A的活性和特異亞基表達(dá)在氯化鎘(CdCl2)染毒不同階段的小鼠肝臟中降低，并和病程相關(guān)[12]，提示PP2A活性在CdCl2致肝臟損傷中起作用。既往研究已經(jīng)證實(shí)PP2A是多種疾病的治療靶點(diǎn)，因此針對(duì)PP2A活性的藥物開發(fā)具有很好的應(yīng)用前景[13]。二甲雙胍(metformin)是目前廣泛使用的口服降糖藥，也用于肝臟疾病的治療[14]。研究已證實(shí)二甲雙胍是PP2A的激動(dòng)劑，通過(guò)靶向PP2Ac-α4-MID1復(fù)合物[15-16]激活PP2A酶活性，抑制腫瘤的發(fā)生[13]。然而，二甲雙胍是否可以緩解CdCl2誘導(dǎo)的肝毒性尚不明確。本研究用二甲雙胍干預(yù)處理鎘染毒的小鼠以及人肝細(xì)胞L02，通過(guò)檢測(cè)肝臟病理、血生化、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)、細(xì)胞熒光強(qiáng)度和細(xì)胞活力等指標(biāo)，初步探討二甲雙胍在CdCl2誘導(dǎo)的肝毒性中的作用和可能機(jī)制，以期為鎘暴露人群的健康防護(hù)提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材 料

氯化鎘、鹽酸二甲雙胍購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；生化分析試劑盒購(gòu)于上海復(fù)興長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；4%多聚甲醛購(gòu)于Asegene公司；TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；SYBR Green I熒光染料購(gòu)于TOYOBO公司。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠分組和染毒8周齡雄性野生型(wild type，WT)和純合子小鼠(PP2A Aα-/-，HO)各24只，隨機(jī)分為4組，包括對(duì)照組(0.9%生理鹽水)、鎘染毒組(1.5 mg/kg CdCl2)、二甲雙胍處理組(100 mg/kg二甲雙胍)、鎘和二甲雙胍聯(lián)用組(1.5 mg/kg CdCl2，100 mg/kg二甲雙胍)。二甲雙胍和氯化鎘的濃度經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索和參考文獻(xiàn)確定，小鼠經(jīng)腹腔注射染毒，連續(xù)7 d。

1.2.2 內(nèi)暴露檢測(cè)對(duì)小鼠生物樣本(血液、肝臟和腎臟)進(jìn)行前處理后，待電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS)儀器各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定，先配置內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液與標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，繪制好標(biāo)準(zhǔn)曲線后，檢測(cè)溶劑對(duì)照與樣本的重金屬含量，最后采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 血生化檢測(cè)小鼠用1%戊巴比妥鈉按10 μL/g進(jìn)行麻醉，腹腔靜脈采血收集到2 mL EDTA抗凝管中。常溫下3 500 r/min離心5 min后收集血漿，利用半自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)小鼠外周血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和 甘 油 三 酯(triglyceride，TG)濃度。

1.2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察小鼠肝組織用4%多聚甲醛固定，并用石蠟包埋切片(厚度4 μm)。經(jīng)脫蠟、染核、分化、反藍(lán)等步驟后用蘇木素-伊紅(HE)染色，用油紅O試劑盒對(duì)肝臟冰凍切片(厚度7 μm)中的脂滴進(jìn)行染色。病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考病理學(xué)臨床研究委員會(huì)提出的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)組織學(xué)特征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.2.5 肝臟組織中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)用TRIzol提取肝臟組織中總RNA；選擇20 μL的反應(yīng)體系合成cDNA；逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?；采用SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白zip14、dmt1、mrp1、oct2、bsep和zip8的mRNA表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)人肝永生化細(xì)胞株L02來(lái)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度約為80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.7 CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)L02細(xì)胞接種24 h后，分為4組，分別為對(duì)照組、鎘染毒組(0、12.5、25、50和100 μmol/L CdCl2)、CdCl2和1 mmol/L二甲雙胍聯(lián)用組、CdCl2和2 mmol/L二甲雙胍聯(lián)用組。處理細(xì)胞24 h后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)L02細(xì)胞活力。

1.2.8 L02細(xì)胞鈣離子水平測(cè)定L02細(xì)胞接種24 h后，用CdCl2和/或二甲雙胍處理(分組同1.2.7)，然后加入Fluo-4 AM孵育30 min，在熒光顯微鏡下檢測(cè)鈣離子標(biāo)志物Fluo-4 AM的熒光強(qiáng)度評(píng)估細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，判斷人肝細(xì)胞L02的胞內(nèi)鎘離子水平變化[18]，并采用ImageJ軟件對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 7.0軟件。不同組別的病理評(píng)分比較使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，不同組別的內(nèi)暴露、血生化、甘油三酯指標(biāo)比較使用Studentst檢驗(yàn)，組間的相對(duì)細(xì)胞活力比較使用one-way ANOVA檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PP2A Aα缺失對(duì)CdCl2誘導(dǎo)小鼠急性肝毒性的影響

小鼠內(nèi)暴露檢測(cè)結(jié)果見圖1A~C。與各自對(duì)照組相比，鎘染毒W(wǎng)T小鼠和HO小鼠的血鎘分別升高了534.74倍和705.60倍，肝鎘分別升高了1 144.46倍和918.05倍，腎鎘分別升高了52.86倍和137.07倍，提示鎘在小鼠血液、肝臟和腎臟中蓄積，但兩種基因型小鼠間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血生化檢測(cè)結(jié)果見圖1D~F。鎘染毒下，WT和HO小鼠的ALT濃度分別升高86.40%和71.67%，AST濃度分別升高3.19%和48.44%，甘油三酯濃度分別升高了31.70%和62.54%。組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1G，HE染色顯示染毒W(wǎng)T小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而在HO小鼠中更加嚴(yán)重，肝細(xì)胞胞漿中可見許多大小不等、邊界清晰的脂質(zhì)空泡。HE染色的病理評(píng)分結(jié)果見圖1H和I，提示HO小鼠肝臟損傷更為嚴(yán)重。油紅O染色也顯示鎘染毒小鼠肝臟出現(xiàn)大量紅色脂滴。綜合以上結(jié)果，表明肝細(xì)胞特異性敲除PPP2R1A基因加重了CdCl2誘導(dǎo)的肝臟損傷，PP2A活性對(duì)于保護(hù)肝臟具有重要作用。

圖1 CdCl2暴露誘導(dǎo)小鼠急性肝臟損傷

2.2 二甲雙胍可緩解CdCl2 誘導(dǎo)的小鼠肝毒性

以往研究表明二甲雙胍是PP2A的激動(dòng)劑[13]，因此我們擬探討二甲雙胍是否可以緩解CdCl2誘導(dǎo)的肝毒性。血生化結(jié)果如圖2A所示，鎘染毒導(dǎo)致WT小鼠的ALT和AST濃度分別升高了86.40%和3.19%，而二甲雙胍處理導(dǎo)致WT染毒小鼠的ALT和AST濃度分別降低了61.14%和44.02%。HE染色的組織病理學(xué)觀察結(jié)果及其病理評(píng)分見圖2B和2C，二甲雙胍和CdCl2聯(lián)用組小鼠的肝損傷程度降低，可見部分結(jié)構(gòu)正常的肝小葉，肝細(xì)胞排列尚整齊，脂質(zhì)沉積不明顯，炎癥浸潤(rùn)程度減輕。油紅O染色結(jié)果見圖2C，和單獨(dú)鎘染毒小鼠相比，二甲雙胍CdCl2聯(lián)用小鼠的肝臟紅色脂滴減少。血生化結(jié)果見圖2D，血漿TG濃度降低了43.75%。綜合以上結(jié)果，表明二甲雙胍可減輕CdCl2誘導(dǎo)的肝毒性。

圖2 二甲雙胍可減輕CdCl2誘導(dǎo)的小鼠肝毒性

2.3 二甲雙胍可能通過(guò)抑制鎘的吸收緩解肝毒性

以往研究發(fā)現(xiàn)PP2A通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響化學(xué)物的肝毒性[19]，因此我們擬探討PP2A活性降低是否調(diào)控鎘的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)從而影響肝毒性。首先檢測(cè)肝臟中6種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA表達(dá)水平。qPCR結(jié)果如圖3所示，和WT小鼠比，HO小鼠中主要介導(dǎo)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白zip14和dmt1的mRNA水平分別升高了16.48%和53.61%，鎘染毒下則分別升高了47.32%和136.23%，而其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mrp1、oct2、bsep和zip8無(wú)明顯變化，提示zip14和dmt1的誘導(dǎo)表達(dá)受PP2A調(diào)控。以往研究表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白zip14[20]和dmt1[21]主要負(fù)責(zé)鎘的吸收與蓄積，提示PP2A活性降低可能促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)鎘的吸收，加重肝臟毒性。因此，我們擬探討PP2A激動(dòng)劑二甲雙胍能否抑制細(xì)胞對(duì)鎘吸收，減輕肝毒性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果見圖5。二甲雙胍對(duì)L02細(xì)胞沒有明顯毒性。鎘染毒導(dǎo)致L02的細(xì)胞活力降低了45.99%，且細(xì)胞熒光強(qiáng)度比對(duì)照增加了2.72倍，提示鎘離子進(jìn)入細(xì)胞。1和2 mmol/L二甲雙胍處理后，細(xì)胞活力比單純CdCl2處理的細(xì)胞分別升高了59.28%和89.78%，細(xì)胞熒光強(qiáng)度則分別降低了40.77%和54.17%，表明二甲雙胍抑制了肝細(xì)胞對(duì)鎘離子的吸收。綜合以上結(jié)果，表明二甲雙胍可能通過(guò)抑制鎘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收減輕肝細(xì)胞毒性。

圖3 小鼠肝臟中各轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA表達(dá)水平(n=6)

圖4 二甲雙胍可減緩鎘的細(xì)胞毒性

圖5 二甲雙胍抑制肝細(xì)胞吸收鎘離子

3 討論

鎘的生物半衰期長(zhǎng)達(dá)30年，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)蓄積在肝臟并引起明顯的肝毒性，因此尋找防治藥物對(duì)于保護(hù)人群健康具有重要意義。本研究從PP2A活性降低加重氯化鎘誘導(dǎo)的急性肝毒性出發(fā)思考，探討PP2A的激動(dòng)劑二甲雙胍的作用，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)CdCl2誘導(dǎo)的肝臟損傷具有一定緩解作用，機(jī)制研究揭示可能是通過(guò)減少鎘離子進(jìn)入肝細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的，研究結(jié)果可為鎘的肝毒性防治提供了新策略。

PP2A介導(dǎo)的蛋白質(zhì)去磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)控點(diǎn)。以往研究證實(shí)了PP2A在細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境污染物應(yīng)激中起著重要作用，如PP2A B56α復(fù)合物通過(guò)調(diào)節(jié)CYP2E1表達(dá)來(lái)影響苯的血液毒性[22]，PP2A B56δ全酶調(diào)控重金屬誘導(dǎo)的熱休克蛋白表達(dá)[23]或介導(dǎo)MTF-1的去磷酸化參與調(diào)節(jié)金屬硫蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響重金屬的細(xì)胞毒性[24]。我們前期用CdCl2對(duì)小鼠染毒3、6和9個(gè)月，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟出現(xiàn)進(jìn)行性炎癥、脂肪變性和肝纖維化改變，且PP2A 的活性降低，并和肝臟損傷進(jìn)程相關(guān)[12]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)PP2A活性降低加重了氯化鎘誘導(dǎo)的肝毒性，提示PP2A 可能是氯化鎘產(chǎn)生毒作用的重要調(diào)控子。一致的是，以往研究也發(fā)現(xiàn)異甘草酸鎂可減少鎘誘導(dǎo)的ROS生成，激活PP2A，減輕鎘誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[25]。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)鎘暴露誘導(dǎo)細(xì)胞中miR-133b 表達(dá)，但抑制PPP2R2D基因(編碼PP2A-B55δ)的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞G2/M 期停滯，細(xì)胞增殖受阻[26]。綜上所述，PP2A活性對(duì)于保護(hù)細(xì)胞抵抗鎘誘導(dǎo)肝臟毒性至關(guān)重要。

副作用限制了金屬螯合劑在重金屬解毒中的應(yīng)用[27]，人們開始關(guān)注一些現(xiàn)有藥物的新用途。比如，褪黑素可通過(guò)抑制TXNIP-NLRP 炎癥小體從而減輕鎘誘導(dǎo)的肝損傷[28]，維生素E 通過(guò)抑制氧化應(yīng)激并激活Nrf2通路，在鎘誘導(dǎo)的亞慢性肝損傷中發(fā)揮著保護(hù)作用[29]。二甲雙胍是一種目前廣泛應(yīng)用的降糖藥物，同時(shí)也用于肝臟疾病治療。研究表明二甲雙胍可增加腸道有益菌的豐度，進(jìn)而改善肝損傷[30]。乳酸受體G 蛋白偶聯(lián)受體81(GPR81)與脂肪分解有關(guān)，對(duì)維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，研究還發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可靶向GPR81 改善實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝[31]。此外，二甲雙胍還可通過(guò)p-AKT/mTOR/LC-3II 通路減輕NAFLD 大鼠肝損傷[32]，抑制乙醇誘導(dǎo)的甘油三酯積累以及血清中ALT 和AST 的增加，激活LKB1/AMPK/ACC 軸進(jìn)而抑制酒精性肝病中的脂質(zhì)形成[33]。斑馬魚模型也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可特異性影響NAFLD 相關(guān)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[34]。二甲雙胍證實(shí)可改善NASH 模型小鼠的病變程度[35]，提示二甲雙胍用于治療肝臟疾病具有潛在的應(yīng)用前景。相一致地，本研究也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍改善氯化鎘誘導(dǎo)的肝毒性，但對(duì)于鎘的慢性肝毒性還需進(jìn)一步研究。

zip14 屬于Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在肝臟表達(dá)[36]，研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)鎘的吸收，增加細(xì)胞對(duì)鎘毒性的敏感性[20]。研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露大鼠胎盤中的dmt 和zip14的表達(dá)水平上調(diào)[37]，流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)高鎘暴露女性的胎盤中dmt1 的mRNA 表達(dá)增加[38]。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)e2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白dmt1 表達(dá)在腸上皮細(xì)胞，主要參與包括鐵和鎘在內(nèi)的多種二價(jià)金屬離子的攝取[21]。此外，dmt1還在肝、腎和腦中表達(dá)，可能和重金屬暴露所導(dǎo)致的多種臟器損傷相關(guān)[39]。我們以往做了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也發(fā)現(xiàn)dmt 和zip14 表達(dá)在PPP2R1A基因敲除小鼠肝臟中有差異[19]，本研究進(jìn)一步證實(shí)了zip14 和dmt1 受PP2A 調(diào)控，并可能和PP2A 介導(dǎo)調(diào)控鎘肝毒性有關(guān)。然而，二甲雙胍影響了鎘離子進(jìn)入肝細(xì)胞，但具體機(jī)制不明確，是否通過(guò)調(diào)控zip14 和dmt1 的表達(dá)還需要進(jìn)一步研究確定。

本研究揭示了二甲雙胍可通過(guò)減少鎘離子進(jìn)入肝細(xì)胞減輕氯化鎘誘導(dǎo)的肝臟毒性，提示二甲雙胍用于防治鎘的肝毒性的應(yīng)用前景，可作為鎘中毒防治的新策略，具有重要的公共衛(wèi)生意義。然而，也有研究表明二甲雙胍具有肝毒性，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步明確二甲雙胍緩解鎘肝毒性的安全劑量范圍。