骨肉瘤中PD-1和CTLA-4的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

閆廣寧，喻玲，賴?yán)m(xù)文，葉丹麗，王蔚，王卓才

0 引言

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青春期，具有局部侵襲和早期肺轉(zhuǎn)移的傾向。新輔助化療聯(lián)合手術(shù)切除可將5年生存率最高提至70%，但其余患者死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[1]。近年來腫瘤免疫療法為惡性腫瘤的治療提供了新的手段，在多種惡性腫瘤中取得了良好療效，其中CTLA-4和PD-1兩種免疫檢查點(diǎn)分子是研究熱點(diǎn)之一。CTLA-4是一種1型跨膜糖蛋白，主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，CTLA-4相對CD28以更高的親和力競爭性結(jié)合B7，降低T細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子的分泌[2-3]。PD-1在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，在T細(xì)胞耗竭中起關(guān)鍵作用。PD-1在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）上的表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤免疫耐受[4]。中和性抗體拮抗以上兩種分子可以在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用。本文檢測了骨肉瘤中CTLA-4和PD-1的表達(dá)，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為骨肉瘤免疫治療的靶點(diǎn)選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集本院2007—2016年初診初治并明確診斷的58例骨肉瘤患者，臨床病理學(xué)特征包括性別、年齡、發(fā)病部位、切除方式、術(shù)前化療、腫瘤最大直徑及Ennecking分期等，見表1。病理診斷經(jīng)2名以上副高以上職稱病理醫(yī)師復(fù)診確認(rèn)。

表1 58例骨肉瘤患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of 58 osteosarcoma patients

1.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

所有含骨標(biāo)本經(jīng)脫鈣（質(zhì)軟標(biāo)本除外）、4%中性福爾馬林固定后石蠟包埋。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過烤片、脫蠟、3%雙氧水封閉、EDTA高壓修復(fù)后，按照Envision法孵育抗體。一抗為CTLA-4（1:250，兔抗人，購自英國Abcam公司）和PD-1（1:200，小鼠抗人，購自加拿大GenomeMe公司）。二抗、抗體稀釋劑及DAB顯色劑均購自丹麥DAKO公司。

1.3 結(jié)果判讀

CTLA-4和PD-1均定位于細(xì)胞膜，出現(xiàn)完整的棕黃色膜染色判定為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)分：<3%為陰性（0分），≥3%～10%為1分，≥10%～<25%為2分，≥25%為3分。陽性細(xì)胞著色程度計(jì)分：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。將上述兩項(xiàng)評分相乘作為最終結(jié)果：0～2分為陰性表達(dá)，3～9分為陽性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師雙盲閱片。

1.4 隨訪

所有患者術(shù)后及化療結(jié)束后皆進(jìn)行門診隨訪、電子病歷和電話追蹤?？偵嫫冢∣S）是指從手術(shù)后第一天至死亡或失訪時(shí)間；無病生存期（DFS）是指從腫瘤切除后到腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)進(jìn)行生存分析時(shí)，采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)法，使用Log rank檢驗(yàn)生存曲線差異。兩離散變量分析采用列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1及CTLA-4表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

PD-1表達(dá)于大部分骨肉瘤標(biāo)本中，其中陽性表達(dá)31例（53.4%）。股骨比其他原發(fā)部位PD-1陽性比例更高（P=0.017）。接受過新輔助化療的患者PD-1陽性比例明顯高于未接受過的患者（P=0.036）。PD-1陽性患者腫瘤復(fù)發(fā)率顯著高于陰性患者（P=0.007）。PD-1陽性患者腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著高于陰性患者（P=0.046）。PD-1表達(dá)與其他臨床病理數(shù)據(jù)比較無明顯差異。CTLA-4在骨肉瘤中表達(dá)較弱，其中陽性19例（32.8%）。CTLA-4陽性患者Ennecking分期較陰性患者更晚，但差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不顯著（P=0.051）。CTLA-4與其他臨床病理數(shù)據(jù)間比較無明顯差異，見圖1、表2。

表2 PD-1和CTLA-4表達(dá)水平與骨肉瘤患者的臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 (n(%))Table 2 Correlation of PD-1 or CTLA-4 expression with clinicopathological characteristics of osteosarcoma patients (n(%))

圖1 PD-1和CTLA-4在骨肉瘤中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of PD-1 and CTLA-4 in osteosarcoma

PD-1和CTLA-4雙陽性12例（20.7%），雙陰性20例（34.5%），單陽性26例（44.8%）。PD-1和CTLA-4雙陽性表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)率顯著高于雙陰性及單陽性組（P=0.035）。雙陽性表達(dá)患者腫瘤轉(zhuǎn)移率顯著高于雙陰性及單陽性組（P=0.047）。其他臨床病理數(shù)據(jù)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.2 PD-1與CTLA-4的表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

本組中失訪12例，死亡27例，術(shù)后復(fù)發(fā)18例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移29例，總生存率約53.4%。生存曲線分析顯示PD-1陰性患者的DFS及OS均顯著長于陽性患者（P=0.020;P=0.022）。CTLA-4陰性患者的DFS顯著長于陽性患者（P=0.014），但兩者OS沒有明顯差異。PD-1和CTLA-4的雙陰性組的預(yù)后最好，雙陽性組的預(yù)后最差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（DFS:P=0.005;OS:P=0.024），見圖3。

圖2 PD-1表達(dá)或CTLA-4表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 2 Correlation of PD-1 or CTLA-4 expression with survival time of osteosarcoma patients

圖3 PD-1和CTLA-4共同表達(dá)情況與骨肉瘤患者生存期的相關(guān)性Figure 3 Correlation of double positive expression of PD-1 and CTLA-4 with survival time of osteosarcoma patients

2.3 骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

經(jīng)單因素分析及查閱文獻(xiàn)后，我們認(rèn)為手術(shù)方式、新輔助化療、Ennecking分期、腫瘤最大徑可能是影響患者預(yù)后的重要因素，因此將以上因素及PD-1和CTLA-4共表達(dá)情況納入Cox多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)Ennecking分期和PD-1、CTLA-4 共表達(dá)情況是DFS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.032,P=0.008），見表4，而在OS中則不是（P=0.101），見表5。

表4 各變量與骨肉瘤患者DFS的Cox回歸分析Table 4 Cox regression analysis of factors predicting DFS of osteosarcoma patients

表5 各變量與骨肉瘤患者OS的Cox回歸分析Table 5 Cox regression analysis of factors predicting OS of osteosarcoma patients

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，常規(guī)治療方式是根治切除和化療的綜合治療，仍有部分患者發(fā)生復(fù)發(fā)或肺轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后生存率顯著下降[4]。目前腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了重大突破，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種實(shí)體瘤治療中有較好療效，但在骨肉瘤等軟組織腫瘤的研究才剛剛起步[5]。

PD-1是免疫檢查點(diǎn)分子之一，主要表達(dá)于T細(xì)胞。PD-1參與免疫抑制，在T細(xì)胞耗竭中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致腫瘤免疫受抑，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6-7]。PD-L1和PD-L2是PD-1的主要配體，有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中PD-L1表達(dá)量與腫瘤轉(zhuǎn)移和死亡率有關(guān)[8-10]。但PD-L1抑制劑是否可以使晚期患者獲益尚有爭議[11]。本組接受新輔助化療后，骨肉瘤中PD-1的表達(dá)升高，提示化療藥物對腫瘤的毒性作用可能引起了免疫微環(huán)境的變化。根治術(shù)后復(fù)發(fā)的患者PD-1表達(dá)升高，推測可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān)，提示免疫細(xì)胞的活性受抑使監(jiān)視殘留腫瘤細(xì)胞的功能失效，提升了腫瘤復(fù)發(fā)率[12]。本研究中PD-1陽性與腫瘤轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05），推測PD-1信號參與了骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與其他腫瘤研究一致[13]。另外股骨患者PD-1表達(dá)明顯高于脛骨及其他部位，PD-1表達(dá)是否與腫瘤部位有關(guān)還需要大宗樣本分析。生存分析表明，PD-1陽性表達(dá)患者的生存期和無病生存期較短，提示了PD-1陽性在骨肉瘤中是預(yù)后指標(biāo)之一。

CTLA-4主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，可以抑制腫瘤免疫反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14-15]。在其他腫瘤研究中都發(fā)現(xiàn)CTLA-4的表達(dá)上調(diào)，且與不良預(yù)后相關(guān)[16]。CTLA-4單抗最先應(yīng)用于治療惡性黑色素瘤，取得了不錯(cuò)的療效，但與PD-1抑制劑治療黑色素瘤相比，其療效稍差而毒性較高，并且與PD-1療法已被應(yīng)用于多種惡性腫瘤治療不同，CTLA-4單抗的應(yīng)用仍然限制在惡性黑色素瘤之中，而在其他腫瘤中效果不佳[17-18]。本組CTLA-4表達(dá)較弱，且與患者Ennecking分期有一定關(guān)聯(lián)（P=0.051），分期較晚的患者CTLA-4表達(dá)比例較高，提示CTLA-4抑制免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤生長。生存分析發(fā)現(xiàn)CTLA-4與OS關(guān)系不密切，但陽性表達(dá)的患者DFS更短，提示CTLA-4可能影響腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，這與其他腫瘤的研究一致[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L1會上調(diào)CTLA-4表達(dá)，進(jìn)而造成治療抵抗[4]，聯(lián)用PD-1和CTLA-4抑制劑療效更好，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到印證[3,19-20]。本組PD-1和CTLA-4雙陽性的患者發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的比例遠(yuǎn)高于雙陰性或單陽性的患者，提示PD-1和CTLA-4在骨肉瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中可能存在協(xié)同作用。因此，PD-1和CTLA-4聯(lián)合檢測是預(yù)測患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較好的指標(biāo)。生存分析中發(fā)現(xiàn)，無論是OS還是DFS，雙陽性患者的預(yù)后較差，而雙陰性預(yù)后則較好，并且是患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由此推測，PD-1和CTLA-4的雙重阻斷可能對骨肉瘤有更好的治療效果，與文獻(xiàn)一致[20]。

綜上所述，本組檢測骨肉瘤樣本中PD-1和CTLA-4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與骨肉瘤患者臨床病理及預(yù)后有相關(guān)性，并且PD-1和CTLA-4的雙陽性表達(dá)患者預(yù)后不良，聯(lián)用PD-1單抗和CTLA-4單抗相比單一免疫療法，可能對骨肉瘤患者療效更好且更易于控制不良反應(yīng)。本研究探索了預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)，并為骨肉瘤免疫治療提供了依據(jù)。