RBM8A基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的作用及其機(jī)制

譚冬梅，張靜靜，師一民，韓賽，耿煒，孫建一，王雅玉，張秀榮

0 引言

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的25%左右，近20年全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。據(jù)中國(guó)癌癥流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)子宮內(nèi)膜癌每年新發(fā)病率為634/105，死亡率為21.8/105[1]。子宮內(nèi)膜癌目前以手術(shù)治療為主，但中晚期及復(fù)發(fā)患者常常因轉(zhuǎn)移等失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且化、放療效果不理想，使其5年生存率僅維持在20%～57%[2-5]。因此，子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)現(xiàn)及治療至關(guān)重要，尋找子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)功能相關(guān)基因，用于早期診斷和治療內(nèi)膜癌的有效分子治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為亟待解決的科學(xué)問題。RNA結(jié)合基序蛋白8A（RBM8A）是外顯子連接復(fù)合體（EJC）的核心因子。EJC在真核生物中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)[6-7]。RBM8A基因位于染色體1q21.1，在細(xì)胞中大量表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，RBM8A促進(jìn)腦惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及遷移[10-11]，且在肝癌中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12-13]。但其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍不明確。本研究擬探討RBM8A對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，探索RBM8A在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用的通路，從而明確其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為開發(fā)子宮內(nèi)膜癌新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜HEC-1A細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海），在RPMI1640（Hyclone Laboratories,Logan,UT,美國(guó)）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（澳大利亞悉尼Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素，并在37℃、5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。

1.2 抗體與試劑

RBM8A抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，E-cadherin 抗體、Vimentin抗體、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3抗體及GAPDH內(nèi)參均購(gòu)自美國(guó)CST有限公司。RBM8A敲低質(zhì)粒及空載質(zhì)粒構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。1×Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。RBM8A引物及GAPDH內(nèi)參引物由北京擎科生物科技有限公司合成。RBM8A引物：正義：5’-GATGGGGACGAGAGCATTCAC-3’，反義：5’-CGCTGTCATAATCCTCACGCA-3’；GAPDH內(nèi)參引物：正義：5’-CTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3’，反義：5’-CTTGCCCACAGCCTTGGCAG-3’。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)RBM8A mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEC-1A細(xì)胞，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中RBM8A mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算RBM8A相對(duì)表達(dá)量，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct方法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 慢病毒感染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEC-1A細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，融合至50%左右時(shí)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入等量病毒上清液（其中無(wú)意義序列shControl為對(duì)照組，shRBM8A為實(shí)驗(yàn)組）感染細(xì)胞6 h后換液，48 h后熒光顯微鏡觀察感染效率，待感染效率達(dá)80%時(shí)，用嘌呤霉素篩選感染成功的HEC-1A細(xì)胞并獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR及Western blot法鑒定慢病毒過(guò)表達(dá)效果。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1A細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為2×104個(gè)/毫升，按每孔200 μl接種于96孔板，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5 d時(shí)每孔加20 μl CCK-8檢測(cè)試劑繼續(xù)培養(yǎng)45 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的OD值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，OD值越大表示活細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞增殖越快。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 取Transwell小室置于24孔板，將shControl、shRBM8A組HEC-1A細(xì)胞，胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，離心后棄上清液，用無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸，使其細(xì)胞密度為5×105個(gè)/毫升。遷移試驗(yàn)：取上述重懸細(xì)胞，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入700 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取出小室，PBS清洗3次，棉簽輕輕擦拭上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.4%結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗干凈并晾干，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)并取平均值。侵襲試驗(yàn)：將基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8稀釋后，均勻鋪在Transwell小室底部膜的上室面（50 μl），室溫干燥后待用。上室加入上述細(xì)胞懸液100 μl，下室內(nèi)加入700 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。后續(xù)操作同遷移試驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 流式凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1×106細(xì)胞/孔接種于6孔板。次日，細(xì)胞貼壁后，加入等量病毒上清液（其中無(wú)意義序列shControl為對(duì)照組，shRBM8A為實(shí)驗(yàn)組），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化至皿底呈花斑狀，用完全培養(yǎng)基終止消化后轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，轉(zhuǎn)速300g，4℃離心5 min，棄上清液。用預(yù)冷的PBS 300g離心力，4℃離心5 min，洗滌細(xì)胞兩次，吸去PBS，加入100 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染液，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng)10～15 min。樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo_V10軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Western blot檢測(cè)蛋白水平 收集各組細(xì)胞，加入MCLB細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)各組蛋白濃度上樣總量25 mg，以80～120 V電壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離后360 mA轉(zhuǎn)膜90 min，封閉1 h后加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，將膜取出，TBST緩沖液清洗3次，加入二抗室溫孵育40 min；TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。在凝膠成像系統(tǒng)利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光顯影并保存數(shù)據(jù)。以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0版本用于統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。計(jì)量資料以（）表示，連續(xù)變量組間比較用Student’st檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)均為雙邊檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RBM8A在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，RBM8A在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)量高于正常子宮內(nèi)膜組織（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 TCGA示RBM8A在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達(dá)Figure 1 TCGA showed that the expression of RBM8A was different in normal endometrial and eddometrial cancer tissues

2.2 慢病毒敲低RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞的效率

細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照組及敲低RBM8A病毒后，收取細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞RNA，并反轉(zhuǎn)錄成CDNA，RT-qPCR法證明其RBM8A基因被敲低。實(shí)驗(yàn)組HEC-1A細(xì)胞中RBM8A mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖2A。此外，收取另一部分細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞蛋白。Western blot法證明在HEC-1A shRBM8A細(xì)胞中RBM8A蛋白表達(dá)降低，見圖2B。提示攜帶重組慢病毒感染HEC-1A細(xì)胞成功。

圖2 敲低RBM8A效率驗(yàn)證Figure 2 Efficiency verification of RBM8A knockdown

2.3 RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后種入96孔板后，每天同一時(shí)間測(cè)細(xì)胞OD值，持續(xù)5天，兩組細(xì)胞的OD值均逐漸升高，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組2～4天OD值均較低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示敲低RBM8A能抑制 HEC-1A細(xì)胞的增殖，見圖3。

圖3 敲低RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of knockdown of RBM8A on the proliferation of HEC-1A cells

2.4 RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)測(cè)定Annexin V染色細(xì)胞的數(shù)量，觀察細(xì)胞凋亡程度。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)RBM8A被敲低后，HEC-1A細(xì)胞凋亡明顯增加（22.97%vs.7.51%,P=0.0010），見圖4。

圖4 敲低RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of RBM8A knockdown on apoptosis of HEC-1A cells

2.5 RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)量明顯減少，見圖5。提示降低RBM8A表達(dá)能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的遷移（P=0.0001）和侵襲（P=0.0013），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 敲低RBM8A對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移和侵襲的影響Figure 5 Effect of RBM8A knockdown on migration and invasion of HEC-1A cells

2.6 RBM8A對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

敲低RBM8A后，HEC-1A細(xì)胞中cleaved-caspase9及cleaved-caspase3表達(dá)明顯升高，見圖6。說(shuō)明敲低RBM8A激活了細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路。

圖6 敲低RBM8A對(duì)相關(guān)凋亡蛋白的影響Figure 6 Effect of RBM8A knockdown on related apoptotic proteins expression

2.7 RBM8A對(duì)EMT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin表達(dá)降低，見圖7。提示敲低RBM8A可抑制 HEC-1A細(xì)胞的EMT過(guò)程。

圖7 敲低RBM8A對(duì)EMT蛋白的影響Figure 7 Effect of RBM8A knockdown on EMT protein expression

3 討論

據(jù)最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和相關(guān)死亡率每年都在上升[14]。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)治療已不斷完善。來(lái)自癌癥的數(shù)據(jù)基因組圖譜（TCGA）項(xiàng)目提高了我們對(duì)子宮內(nèi)膜癌異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)[15-17]。這種新知識(shí)已經(jīng)更加開放了針對(duì)復(fù)發(fā)性疾病的靶向治療選擇。隨著肥胖率繼續(xù)上升，子宮內(nèi)膜癌預(yù)防和治療都需要新的方法，來(lái)解決不斷增加的子宮內(nèi)膜癌病例和相關(guān)死亡。

無(wú)意義介導(dǎo)的mRNA衰減（nonsense-mediated RNA decay,NMD）通路中關(guān)鍵因子的異常表達(dá)與各種類型的癌癥有關(guān)[18]。NMD通路通過(guò)消除終止密碼子mRNA的轉(zhuǎn)錄，以及降解編碼細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和細(xì)胞存活的蛋白質(zhì)，幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[19-20]。有文獻(xiàn)報(bào)道NMD功能的喪失會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[21]，這表明靶向NMD通路的關(guān)鍵因子可能對(duì)癌癥治療有效[22-24]。

其中一個(gè)NMD因子是RBM8A，它是外顯子連接復(fù)合體的核心因子，有助于調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡[8,25-27]。RBM8A在多種類型的腫瘤中異常表達(dá)，包括宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、骨髓瘤和肝細(xì)胞癌[28-30]。文獻(xiàn)報(bào)道，它與轉(zhuǎn)錄因子STAT3結(jié)合，促進(jìn)其DNA結(jié)合，從而上調(diào)靶基因[31]。然而RBM8A在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RBM8A在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，因此我們探討了RBM8A表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，子宮內(nèi)膜癌組織中RBM8A表達(dá)升高，抑制RBM8A的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。然而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的具體作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探討。

凋亡是一種嚴(yán)格受控的細(xì)胞死亡模式，以核固縮、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜起泡和DNA片段化為特征。凋亡的核心調(diào)控分子是caspase。我們觀察到，敲低RBM8A后細(xì)胞凋亡增加。為了驗(yàn)證這一現(xiàn)象，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)有活性的caspase蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低RBM8A后，cleaved-caspase9及cleaved-caspase3表達(dá)增加，這提示與凋亡信號(hào)和活動(dòng)緊密相聯(lián)系的“啟動(dòng)型”caspase-9通過(guò)剪切和活化激活下游的“執(zhí)行型”caspase-3，從而引起最終細(xì)胞程序性死亡。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。EMT在胚胎發(fā)育、慢性炎性反應(yīng)、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用[32]，其主要的特征有細(xì)胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）表達(dá)減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等。通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。闡明調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程的分子機(jī)制，明確其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的病理意義，并探索基于EMT關(guān)鍵分子的診斷方法及靶向EMT關(guān)鍵分子的治療手段是腫瘤轉(zhuǎn)移中EMT機(jī)制研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究結(jié)果顯示，敲低RBM8A后HEC-1A 細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明 HEC-1A細(xì)胞EMT過(guò)程受到抑制，提示降低RBM8A后是通過(guò)抑制EMT過(guò)程導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲受到抑制。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默RBM8A基因可致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制EMT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是其作用機(jī)制。由于本課題組條件有限，未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用。未來(lái)可繼續(xù)通過(guò)人體組織表達(dá)驗(yàn)證及動(dòng)物皮下成瘤驗(yàn)證RBM8A在子宮內(nèi)膜癌中的作用及機(jī)制。RBM8A有望成為子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療新的靶點(diǎn)。