胰腺癌中OASL的表達及其對癌細胞增殖和遷移的影響

張人丹，趙春艷，姚佳欣，胡先華，母波

0 引言

胰腺癌是一種臨床癥狀隱匿、惡性程度高且死亡率高的消化道惡性腫瘤。據(jù)最新臨床文獻統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前胰腺癌仍然是惡性腫瘤里五年生存率最低的腫瘤，僅為10%[1]。胰腺癌的治療方法仍以根治性手術(shù)切除為主，但是胰腺癌往往發(fā)現(xiàn)較晚，患者確診時，因腫瘤發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移或不可手術(shù)切除而喪失手術(shù)機會[2]。近年來在其他腫瘤治療中取得良好效果的靶向治療、免疫治療等在胰腺癌的臨床試驗中效果仍不明顯。因此，迫切需要尋求新的生物標志物和新的靶向位點，探究其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

OASL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼59kDa的蛋白質(zhì)，故又稱p59OASL。它位于12q24.31，有7個外顯子，主要在骨髓、胃和肺中表達，與OAS1、OAS2和OAS3一起形成干擾素誘導的蛋白質(zhì)保守家族。有報道指出，OASL基因可能是維持肺癌細胞對ac-Roots敏感度的決定性調(diào)節(jié)因子之一，并可能與耐藥性的發(fā)展有關(guān)[3]。本研究在對TCGA數(shù)據(jù)庫中OASL基因進行生物信息學分析基礎(chǔ)上，對胰腺癌細胞株panc-1敲減和過表達OASL，探討其對胰腺癌細胞生物學行為的影響及其相關(guān)分子機制。希望能為胰腺癌的臨床診治尋找到新的靶向標志物，優(yōu)化診治方案，延長患者的生存期。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人類胰腺癌panc-1細胞購自中國上海中科院細胞庫。敲減panc-1細胞OASL基因的shRNA以及過表達OASL基因的慢病毒均購買于上海吉凱基因科技有限公司。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號：PM150210）、胎牛血清（貨號：164210-50）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胰酶（貨號：SH30042.01）、雙抗（貨號：SV30010）購自美國Hyclone公司，Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑（貨號：C0533）、嘌呤霉素（貨號：ST551）、RIPA裂解液（貨號：P0013B）、10% Tris-Gly預制膠（貨號：P0455S）、PVDF膜（貨號：FFP32）、兔抗人GAPDH多克隆抗體（貨號：AF1186）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（貨號：A0208）、MTT試劑（貨號：ST316）均購自上海碧云天生物科技公司，傷口愈合插件（貨號：80209）購自德國Ibidi公司，兔抗人OASL多克隆抗體（貨號：821065）購自成都正能生物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas（貨號：K1622）、PowerUp SYBR Green預混液（貨號：A25742）均購自美國Thermo Scientific公司，qPCR引物均購自北京擎科生物科技有限公司。GAPDH引物序列：正義：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反義：5’-GGCTGTTGTCATACTICICATGG-3’；OASL引物序列：正義：5’-CTGATGCAGGAACTGTATAGCAC-3’，反義：5’-CACAGCOTCTAGCACCTCTT-3’。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學方法分析OASL與胰腺癌預后的關(guān)系 本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析不同疾病狀態(tài)（腫瘤或正常）下OASL基因的表達情況及生存分析。在數(shù)據(jù)庫中選取Single Gene Analysis，輸入基因名稱：OASL，再分別點擊Boxplots和Stage Plots，在Datasets Selection中選擇PAAD；在Survival中選擇Survival Plots，在Methods中分別選擇Overall Survival和Disease Free Survival。

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫 (http://kmplot.com/analysis/) 評估OASL的表達與胰腺癌患者總生存期（OS）和無復發(fā)生存期（RFS）的關(guān)系。在該平臺中點擊pan-cancer RNA-seq，Gene symbol中輸入目的基因OASL，Split patients中選擇Auto select best cutoff，Cancer中選擇Pancreatic ductal adenocarcinoma，Survival分別選擇OS和RFS。從TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索胰腺癌患者的臨床資料，用R語言對數(shù)據(jù)進行分析。調(diào)整后的P值<0.05和|log2（倍數(shù)變化）| >1被定義為閾值。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 細胞培養(yǎng)：人類胰腺癌panc-1細胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

shRNA轉(zhuǎn)染：當細胞生長狀態(tài)良好，覆蓋培養(yǎng)皿約90%面積時，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化細胞，再加入完全培養(yǎng)基配制成細胞懸液，以每孔3×105個細胞接種到6孔板內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，當每孔細胞密度達到70%～80%，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)基。取一個EP管，按照說明書以每孔加入125 μl Opti-MEM，再加入2.5 μg質(zhì)粒，最后加入4 μl Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑（質(zhì)粒用量（μg）和Lipo8000?（μl）的用量比例為1:1.6）配置好混合液。每孔加入125 μl轉(zhuǎn)染試劑—質(zhì)粒混合物，輕輕混勻。放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。加入含嘌呤霉素（Puromycin）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞。

慢病毒轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的panc-1 細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合度達到20%～30%時，按照說明書推薦的MOI值（MOI=10），加入稀釋為1×108TU/ml濃度的病毒和HitransG P液。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h后，更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞。

實驗分組：將shRNA轉(zhuǎn)染所獲得的OASL基因穩(wěn)定低表達的panc-1細胞株命名為KD-OASL組，轉(zhuǎn)染的陰性對照的panc-1細胞株命名為KD-NC組。將病毒轉(zhuǎn)染所獲得的OASL基因穩(wěn)定高表達的panc-1細胞株命名為OE-OASL組，轉(zhuǎn)染的陰性對照的panc-1細胞株命名為OE-NC組。

1.2.3 RT-qPCR實驗 取處于對數(shù)生長期的細胞，提取RNA。采用20 μl體系反轉(zhuǎn)錄。按順序在EP管中加入cDNA模板3 μg、Oligo(dT)18Primer 1 μl、Random Hexamer Primer 1 μl、RNA free ddH2O配滿12 μl?；靹颍? 000 r/min，短暫離心10 s，65℃孵育5 min，冰上冷卻，1 000 r/min，離心10 s，再冰上冷卻。按順序加入5× Reaction Buffer 4 μl、RiboLock RNase Inhibitor 1 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、ReverAidTMReverse Transcriptase 1 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，75℃ 5min。使用10 μl體系進行RT-qPCR。每組加入cDNA 2 μl，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward Primer 0.2 μl，Reverse Primer 0.2 μl，ddH2O 2.6 μl。反應(yīng)條件為：50℃ 120 s，95℃ 120 s，95℃ 15 s，57℃15 s，72℃ 60 s，95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，37℃ 30 s，45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，轉(zhuǎn)染效率用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.4 Western blot實驗 RIPA與蛋白酶抑制劑按照100:1的比例混勻，用于裂解細胞。取適量提取的蛋白，與5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以4:1的體積比例混勻，60℃煮15 min。取10% Tris-Gly預制膠，在各泳道中加入25 μg蛋白進行電泳。用0.45 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。再加入稀釋好的一抗，4℃緩慢搖動孵育過夜。加入稀釋好的二抗，室溫在搖床上緩慢搖動孵育1 h。將配好的化學發(fā)光液滴在PVDF膜上，在熒光成像儀內(nèi)進行成像檢測。Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5 MTT實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞分別接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，每組5個復孔。待細胞貼壁后，在24、48、72、96、120 h分別加入MTT試劑，每孔10 μl，置于培養(yǎng)箱孵育4 h，吸去上清液，小心不要吸掉孔底部形成的深紫色產(chǎn)物formazan，每孔再加入100 μl DMSO，將96孔板放在搖床上緩慢搖動30 min，待formazan結(jié)晶完全溶解后，于酶標儀595 nm處檢測各組細胞的吸光度值。

1.2.6 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞分別接種6孔板中，每孔300個細胞，每組3個復孔，每孔加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約10天，待長出肉眼可見的克隆，去掉培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用4%的多聚甲醛對細胞固定15 min，吸棄4%的多聚甲醛，加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，晾干，拍照。使用 Image J 軟件計數(shù)各組克隆數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗 取對數(shù)生長期的細胞分別接種于傷口愈合插件中，每孔3×104個細胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞長至孔底90%以上面積時，取出小室插件，PBS清洗2次，加入無血清培養(yǎng)基，分別在0、12、24、36、48 h拍照，用Image J軟件計算劃痕面積。

1.2.8 Transwell遷移實驗 取對數(shù)生長期的細胞，用無血清培養(yǎng)基制備成濃度為每毫升1×105個細胞懸液，取出Transwell小室放入24孔板，向每個小室的上室加入200 μl重懸的細胞懸液，下室加入600 μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用PBS清洗小室2次，加入4%的多聚甲醛固定15 min，吸棄4%的多聚甲醛，再加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，晾干后在顯微鏡下觀察，拍照。使用Imaging J軟件計數(shù)各組細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

One-way ANOVA分析OASL基因在胰腺癌腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達差異；Log rank檢驗分析OASL基因表達與胰腺癌患者臨床預后的相關(guān)性；t檢驗分析OASL基因差異表達；所有實驗均獨立重復三次。應(yīng)用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用表示，兩組計量資料之間比較采用t檢驗，三組及以上計量資料采用單因素方差分析。GraphPad Prism 9和Image J軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理和繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OASL表達差異分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，OASL在腫瘤組織中高表達，見圖1A～B。并且，OASL基因在胰腺癌Ⅰ期表達量較低，而在Ⅱ～Ⅳ期中OASL基因表達顯著升高，見圖1C，說明OASL的表達與胰腺癌的不同病理分期差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.00262）。

圖1 OASL基因過表達后與腫瘤增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達Figure 1 Expression of proteins related to tumor proliferation,migration,and invasion after the overexpression of OASL gene

2.2 不同OASL表達的患者生存分析

分析發(fā)現(xiàn)，OASL高表達的胰腺癌患者OS明顯短于低表達患者（P<0.05），而OASL表達量與患者的DFS無關(guān)（P=0.63），見圖2A～B。Kaplan-Meier plotter評估發(fā)現(xiàn)，OASL的表達與胰腺癌患者的OS和RFS均相關(guān)（P=0.001,P=0.03），見圖2C～D。

圖2 GEPIA(A,B)和Kaplan-Meier plotter(C,D)中胰腺癌患者OASL表達量與總生存期、無病生存期和無復發(fā)生存期的關(guān)系Figure 2 Relationship between OASL expression and OS,DFS and RFS of patients with pancreatic cancer in GEPIA(A,B) and Kaplan-Meier plotter(C,D) database

2.3 OASL表達與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

根據(jù)OS的最佳閾值將TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者（n=174）分為高OASL表達組和低OASL表達組。結(jié)果顯示，兩組OASL的表達與患者年齡、TNM分期、殘留腫瘤、生活狀況等有關(guān)（P<0.05），見表1。

表1 TCGA中胰腺癌患者OASL表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 (n(%))Table 1 Association between OASL expression and clinicopathological parameters in patients with pancreatic cancer in TCGA database (n(%))

2.4 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率

將用shRNA轉(zhuǎn)染后的細胞用嘌呤霉素持續(xù)篩選，經(jīng)過擴增后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均高于80%；通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定高表達OASL的panc-1細胞，各組細胞的轉(zhuǎn)染效率高于80%，見圖3A。

2.5 RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)染細胞中OASL基因表達

與胰腺癌panc-1細胞和KD-NC細胞相比，KDOASL細胞OASL基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.001;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.001）；與胰腺癌panc-1細胞和OE-NC細胞相比，OE-OASL細胞的OASL在分子水平的表達顯著增加（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.006），見圖3B。

2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中OASL基因在蛋白水平的表達

實驗證明，在蛋白水平上KD-OASL細胞OASL的表達顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.009;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.008），OE-OASL細胞的OASL表達明顯增高（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.005;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.006），見圖3C。

圖3 細胞熒光(A)、RT-qPCR(B)和Western blot實驗(C)檢測OASL敲減和過表達效率Figure 3 Knockdown and overexpression efficiency determined by cell-fluorescence(A),RT-qPCR(B),and Western blot analysis(C)

2.7 MTT實驗檢測OASL基因?qū)毎鲋车挠绊?/h3>

結(jié)果顯示：KD-OASL細胞的增殖能力顯著低于panc-1和KD-NC細胞，48 h時開始差異有統(tǒng)計學意義（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.031;KDOASL組vs.KD-NC組，P=0.033），而OE-OASL細胞的增殖能力與panc-1細胞和OE-NC細胞相比明顯增高（48 h時,OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.045;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.044），見圖4A。

2.8 平板克隆實驗檢測OASL基因?qū)σ认侔┘毎寺∧芰Φ挠绊?/h3>

與panc-1和KD-NC相比，KD-OASL的集落形成能力顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.006），OE-OASL細胞集落形成能力顯著提高（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.008;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.007），見圖4B，結(jié)果與MTT實驗一致。

圖4 MTT法(A)和平板克隆法(B)檢測KD-OASL和OE-OASL的增殖能力Figure 4 Proliferation ability of KD-OASL and OE-OASL detected by MTT(A) and plate-cloning(B) assay

2.9 劃痕實驗檢測OASL基因?qū)σ认侔┘毎w移能力的影響

與panc-1細胞和KD-NC細胞相比，KD-OASL細胞的遷移能力被顯著抑制（48 h時,KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.004;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.003），而OE-OASL細胞的遷移能力顯著增強（48 h時,OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.004;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.003），見圖5A，說明OASL基因與panc-1細胞的遷移能力呈顯著正相關(guān)性。

2.10 Transwell 實驗檢測OASL基因?qū)σ认侔┘毎w移能力的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KD-OASL細胞組穿過的細胞數(shù)明顯少于panc-1細胞組和KD-NC細胞組（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.009;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.010），而OE-OASL細胞組穿過的細胞數(shù)顯著增加（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.005），見圖5B。這說明OASL基因能影響胰腺癌panc-1細胞的遷移能力。

圖5 劃痕(A)和Transwell遷移實驗(B)檢測KD-OASL和OE-OASL的遷移能力Figure 5 Migration ability of KD-OASL and OE-OASL detected by scratch assay(A) and Transwell experiments(B)

2.11 Western blot檢測增殖、遷移相關(guān)蛋白的變化情況

結(jié)果顯示，在KD-OASL組中p-STAT3的表達顯著提高（均P=0.003），而STAT3（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.019;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.013）、BAK（均P=0.003）的表達水平顯著降低，見圖6A，OE-OASL細胞組中卻顯示相反的結(jié)果，p-STAT3的表達被抑制（均P=0.004），STAT3（均P=0.019）和BAK（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.001;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.002）表達水平明顯增高，見圖6B。

圖6 OASL基因敲減(A)和過表達(B)后與腫瘤增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達Figure 6 Expression of proteins related to tumor proliferation,migration,and invasion after knockdown(A) and overexpression(B) of OASL gene

3 討論

胰腺癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，診斷和治療難度較大。其中約90%是起源于導管上皮的導管腺癌[4]。近年，雖然關(guān)于胰腺癌的治療得到了廣泛的發(fā)展，包括手術(shù)治療、放射治療、化療以及基因治療等。但因為缺乏特定的癥狀和早期標志物，85%的患者在確診時已是局部晚期和（或）發(fā)生轉(zhuǎn)移。患者術(shù)后5年生存率僅15%～20%[5-8]。常規(guī)化療藥物存在非特異性分布的局限性，導致生物利用度差、血液清除速度快、在體液中的溶解度相對較差[9-10]。因此，尋找具有胰腺癌高效性、特異性的生物標志物及治療方法非常重要。

Zhang等[11]的研究指出OAS1在胰腺癌中高表達，而OAS1的高表達與患者預后不良有關(guān)。有報道指出，OASL基因可能是維持肺癌細胞對acRoots敏感度的決定性調(diào)節(jié)因子之一，并可能與耐藥性的發(fā)展有關(guān)[4]。然而OASL基因表達與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮有報道。

KRAS作為胰腺癌突變最高的基因，涉及包括STAT3在內(nèi)的多條信號通路影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[12-16]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）家族的一員，它以非活化的狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，該蛋白具有與酪氨酸磷酸化信號通路偶聯(lián)的功能。該家族能與DNA結(jié)合，由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b以及STAT6組成[17]。p-STAT3是活化的STAT3，與靶基因啟動子上特異的DNA反應(yīng)元件結(jié)合，影響腫瘤細胞增殖、凋亡及浸潤，從而影響腫瘤的發(fā)展[18-19]。研究指出，STAT3與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在腫瘤組織中STAT3被異常持續(xù)激活，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細胞凋亡[20]。已有大量研究證實STAT3與胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程有關(guān)[21]。BAK是位于STAT3下游的BCL-2家族的一員，具有促進細胞凋亡的作用，并且是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個定位在線粒體上的促凋亡蛋白成員[22]。BAK廣泛分布于多種腫瘤中。有研究指出，BAK可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[23-25]。因此本研究希望通過探索OASL與STAT3信號通路的聯(lián)系，嘗試找到OASL基因參與胰腺癌細胞增殖和遷移改變的一些新的機制。

本研究利用質(zhì)粒和慢病毒構(gòu)建了OASL穩(wěn)定低表達和過表達的胰腺癌panc-1細胞株，然后檢測KD-OASL細胞株和OE-OASL細胞株的細胞增殖、克隆形成和遷移能力的變化，以及這些生物學行為變化相關(guān)的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，OASL敲減后細胞增殖減慢，克隆形成能力減弱，遷移能力降低，敲低株中STAT3、BAK的表達被抑制，而p-STAT3的表達水平顯著提高；過表達OASL的效果相反，提示OASL可能通過STAT3信號通路影響細胞的生物學行為。本研究為探索OASL調(diào)控胰腺癌細胞生物學行為改變所涉及通路及具體作用機制提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，也為制定相應(yīng)的治療策略、改善患者預后奠定了基礎(chǔ)。