阿克替苷通過調(diào)控ERK1/2信號通路抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

袁倩倩，何昱靜，溫雪，張久聰，鄭英，盧利霞，李斌，于曉輝

0 引言

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球危害人類健康常見的惡性腫瘤之一。由于腫瘤復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和異質(zhì)性，就診時多數(shù)已發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。阿克替苷（acteoside,ACT），是一種水溶性的苯丙素苷類化合物，具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗菌[3]、抗動脈粥樣硬化[4]、抗腫瘤[5]等多種藥理活性。ACT在肝癌細(xì)胞中的具體作用和機(jī)制尚無更深入的研究。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）作為惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的第一步，是一個動態(tài)、可逆的過程，而抑制EMT發(fā)生可作為抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的一種重要手段。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常調(diào)控有關(guān)[6]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2）作為MAPK信號通路的亞通路在肝癌細(xì)胞的EMT、侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要作用[7]。目前尚未見有關(guān)ACT通過ERK1/2信號通路影響肝癌細(xì)胞EMT的具體作用和機(jī)制的研究報道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬初步探討ERK1/2信號通路在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討中草藥化合物ACT與肝癌生物學(xué)機(jī)制的相關(guān)性，為ACT治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人肝癌HCCLM3細(xì)胞（中國上?？茖W(xué)院上海細(xì)胞庫）；ACT（南京景竹生物科技有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白、CCK-8試劑（均購自美國Gibco公司）；胎牛血清（美國沃卡威生物技術(shù)有限公司）；PBS（美國Labconco公司）；無血清凍存液（英國Whatman公司）；0.1%結(jié)晶紫（北京索萊寶生物科技有限公司）；ERK1/2抑制劑PD98059、SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（均購自美國MedChemExpress公司）；5×蛋白上樣緩沖液、RIPA強(qiáng)裂解液、PMSF裂解液、10%SDS、Tris-HCL緩沖液、PAGE膠凝固劑、促凝劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL Plus化學(xué)發(fā)光顯色液（均購自北京Solarbio科技有限公司）；E-cadherin抗體（ab231303）、N-cadherin抗體（ab76011）（均購自英國Abcam公司）；ERK1/2抗體（AF0155）、p-ERK1/2抗體（AF1015）、Beta actin抗體（AF7018）、辣根酶標(biāo)記酶山羊抗兔IgG（S0001）（均購自美國Affinity公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HCCLM3細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗（1×105u/L）的高糖DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行細(xì)胞換液、傳代、凍存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖 按藥物濃度設(shè)置5組（0、40、80、120、160 μmol/L），取對數(shù)生長期的肝癌HCCLM3細(xì)胞，各組按5×103個細(xì)胞/孔接種于3個96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，加入上述不同濃度的ACT藥物，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液培養(yǎng)30 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度（OD）值，分析細(xì)胞的增殖能力，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞抑制率，并篩選出最佳抑制濃度和時間。

細(xì)胞抑制率=（對照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動能力 在鋪板前用Marker筆在6孔板背面均勻劃橫線，每孔3～5條。將肝癌HCCLM3細(xì)胞按5×105個/孔接種于培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待75%～85%細(xì)胞貼壁后用10 μl槍頭垂直劃痕。磷酸鹽緩沖溶液PBS洗細(xì)胞3次，加入不同濃度ACT。分別在0、12、24 h后每孔選取5個視野在顯微鏡下拍照記錄。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 在4℃條件下將基質(zhì)膠按1:8稀釋，吸取60 μl包被Transwell小室上室面，置于培養(yǎng)箱使基質(zhì)膠聚合成凝膠。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的ACT處理24 h。制備細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為（1×104～1×105）個/毫升。吸取200 μl細(xì)胞懸液加入小室。24孔板下室加入600 μl含20%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出小室，放入燒杯中PBS洗2遍，95%乙醇固定30 min。用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗3遍。放置在顯微鏡下觀察，分別選取五個視野，用Image J軟件計(jì)數(shù)穿過小室的肝癌細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)在小室底部膜的上室不鋪膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時定量PCR檢測ACT對ERK1/2信號通路和EMT相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 不同濃度的ACT處理細(xì)胞24 h，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別提取細(xì)胞的總RNA，熒光定量PCR儀檢測ERK1/2信號通路和EMT相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)量。ERK1基因上游引物序列為5'-TCAACACCACCTGCGACCT-3'，下游為5'-CGTAGCCACCTGCGACCT-3'；ERK2基因上游引物為5'-TGGAGCAGTATTACGACCCG-3'，下游為5'-TTGAGCTTTTCCTTAGGCAAGT-3'；E-cadherin基因上游引物為5'-GCCCCGCCTTATGATTCTC-3'；下游為5'-GCCCCATTCGTTCAAGTAGTC-3'；N-cadherin上游基因引物為5'-ACCAGGTTTGGAATGGGACA-3'，下游為5'-TTGGGTGAAGGGGTGCTTG-3'；GAPDH基因上游引物為5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游為5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGAG-3'。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用Real-time PCR試劑盒SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit進(jìn)行，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s進(jìn)行40個循壞，所有信息由熒光定量PCR儀收集。2-ΔΔct法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測ACT對ERK1/2信號通路和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h，加入不同濃度ACT處理24 h，按細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞蛋白。按照BCA試劑盒說明書，檢測各組蛋白濃度。蛋白上樣每孔取20 μg蛋白。蛋白電泳條件是上膠80 V，30 min，分離膠120 V，1.5 h，電泳后用1×TBST清洗3次、每次8 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件是2300 MA、轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉封閉2 h，封閉完成后分別添加一抗anti-ERK1/2（1:1 000）、anti-p-ERK1/2（1:2 000）、anti-Ecadherin（1:1 000）、anti-N-cadherin（1:10 000）、anti-Beta actin（1:1 0000），4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液洗膜3次，添加二抗IgG（1:5 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，拍照記錄，使用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；多組之間比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACT對肝癌細(xì)胞增殖的影響

隨著ACT藥物濃度和作用時間的增加，可明顯抑制肝癌HCCLM3細(xì)胞的增殖。當(dāng)ACT濃度在160 μmol/L且作用時間為24 h時，其對人肝癌HCCLM3細(xì)胞的抑制作用最明顯，并計(jì)算IC50約為102 μmol/L，見表1。因此，依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們擬選擇ACT低濃度80 μmol/L和高濃度120 μmol/L、且作用時間為24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 ACT對HCCLM3肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響 (%)Table 1 Effect of ACT on proliferation inhibition rate of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells (%)

2.2 ACT對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

將實(shí)驗(yàn)分為4組，即對照組（0 μmol/L）、ACT濃度80 μmol/L組、ACT濃度120 μmol/L組、陽性對照組（PD98059抑制劑組）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四組肝癌HCCLM3細(xì)胞作用0、12、24 h后，與對照組相比，隨著ACT藥物濃度增加細(xì)胞遷移能力明顯降低；與PD98059抑制劑組相比，ACT濃度80 μmol/L和120 μmol/L組細(xì)胞遷移能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1、表2。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，4組肝癌細(xì)胞作用24 h后，80 μmol/L和120 μmol/L ACT組細(xì)胞的遷移數(shù)與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），PD98059抑制劑組與120 μmol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2、表2。

表2 各組肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目比較 (n=6,)Table 2 Comparison of migration and invasion number of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells among the groups(n=6,)

表2 各組肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目比較 (n=6,)Table 2 Comparison of migration and invasion number of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells among the groups(n=6,)

Notes: a: P<0.05,b: P<0.01,c: P<0.001,compared with the control group.

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測ACT對肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移能力的影響 (×10)Figure 1 Effect of ACT on migration ability of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells by scratch test (×10)

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測ACT對肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移能力的影響 (×20)Figure 2 Effect of ACT on migration ability of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells by Transwell test (×20)

2.3 ACT對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，作用24 h后，與對照組相比，ACT 80 μmol/L組侵襲細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PD98059抑制劑組與120 μmol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3和表2。這表明ACT能抑制肝癌HCCLM3細(xì)胞的侵襲能力，并隨藥物濃度增加其能力越弱。

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測ACT對肝癌HCCLM3細(xì)胞侵襲能力的影響 (×20)Figure 3 Effect of ACT on invasion ability of hepatoma HCCLM3 cells by Transwell test (×20)

2.4 ACT通過ERK1/2信號通路對肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA的影響

2.4.1 ACT對ERK1/2信號通路基因mRNA的影響 對照組ERK1 mRNA的表達(dá)與ACT 120 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖4A；ACT 120 μmol/L組和PD98059抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ACT 120 μmol/L組ERK2 mRNA的表達(dá)與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而其余各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4B。這表明ACT對肝癌細(xì)胞的作用與ERK1/2信號通路相關(guān)。

2.4.2 ACT對肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin mRNA的影響 與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)，見圖4C；而ACT 120 μmol/L組與PD98059抑制劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組N-cadherin mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著藥物濃度的增高下調(diào)更顯著；ACT 120 μmol/L組與PD98059抑制劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4D。

圖4 ACT對肝癌細(xì)胞ERK1(A)、ERK2(B)、E-cadherin(C)、N-cadherin(D) mRNA的表達(dá)Figure 4 Effect of ACT on mRNA expression of ERK1(A),ERK2(B),E-cadherin(C),and N-cadherin(D) in hepatocellular carcinoma cells

2.5 ACT通過ERK1/2信號通路對肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

2.5.1 ACT對ERK1/2信號通路蛋白的影響 Western blot法測定各組細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，見圖5。各組ERK1/2蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6A～B。

圖5 肝癌細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)Figure 5 Protein expression of ERK1/2,p-ERK1/2,E-cadherin and N-cadherin in hepatocellular carcinoma cells

2.5.2 ACT對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin的影響 與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，其中，ACT 120 μmol/L組上調(diào)更顯著（P<0.0001）；而ACT 120 μmol/L組與PD98059抑制劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6C。與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組間N-cadherin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ACT 120 μmol/L組與PD98059抑制劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6D。

圖6 ACT對肝癌細(xì)胞ERK1/2(A)、p-ERK1/2(B)、E-cadherin(C)、N-cadherin(D)蛋白水平的影響Figure 6 Effect of ACT on protein levels of ERK1/2(A),p-ERK1/2(B),E-cadherin(C) and N-cadherin(D)

3 討論

ACT是從多種中草藥中提取的一種水溶性化合物，可通過多靶點(diǎn)、多途徑抑制惡性腫瘤，如口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、結(jié)腸癌[9]和膠質(zhì)細(xì)胞瘤[10]的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期研究表明，ACT可通過調(diào)控ERK5、p38MAPK、JNK信號通路進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生物學(xué)變化[7,11-12]。ERK1/2作為MAPK信號通路的亞通路，其是否也可影響肝癌細(xì)胞的EMT尚無報道。為了進(jìn)一步研究ACT是否通過調(diào)控ERK1/2信號通路抑制肝癌HCCLM3細(xì)胞的EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ACT可明顯抑制肝癌HCCLM3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

ERK1/2是MAPK信號通路的亞通路，越來越多的研究表明其在肝細(xì)胞癌中異常表達(dá)。Zhao等[13]的研究表明槲皮素作為一種有效的肝臟保護(hù)劑，在肝癌晚期可通過MEK1/ERK1/2信號通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散。趙嘉琪[14]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK可通過調(diào)控ERK1/2通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的增殖和線粒體凋亡。李玉龍等[15]的研究表明，高濃度健脾解毒方能延緩荷瘤鼠惡液質(zhì)的發(fā)生和進(jìn)展，這提示可能與健脾解毒方上調(diào)TCR、ERK1/2及p-ERK1/2有關(guān)。吳志賢等[16]通過構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)siRNA沉默Id-1，抑制人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生長，其機(jī)制可能與調(diào)控ERK1/2 MAPK信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ACT作用于肝癌細(xì)胞后p-ERK1/2蛋白和mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.05），且呈濃度依賴性，而120μmol ACT與PD98059抑制劑組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。據(jù)此，我們推測ACT可通過下調(diào)ERK1/2信號通路進(jìn)而抑制人肝癌HCCLM3細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。

EMT的發(fā)生是多種蛋白分子、生長因子和轉(zhuǎn)錄因子共同作用的結(jié)果。肝癌細(xì)胞的侵襲遷移與EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EMT發(fā)生的特點(diǎn)為上皮細(xì)胞連接蛋白E-鈣黏蛋白基因的表達(dá)下調(diào)，蛋白質(zhì)產(chǎn)物N-鈣黏蛋白、波形蛋白上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)黏附。文獻(xiàn)[17]表明，小檗胺可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與其調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。劉博佳等[18]實(shí)驗(yàn)顯示，羽扇豆醇可抑制異種移植HepG2細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤的生長，腫瘤組織中E-cadherin蛋白表達(dá)增高，N-cadherin蛋白表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)前期研究也證實(shí)，ACT可抑制肝癌HepG2細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]。在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ACT處理后人肝癌HCCLM3細(xì)胞中E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，而N-cadherin的表達(dá)明顯下降。進(jìn)一步證實(shí)ACT可抑制肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，其可能通過下調(diào)ERK1/2信號通路來實(shí)現(xiàn)，其具體作用機(jī)制與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)有關(guān)。

綜上，ACT可通過調(diào)控ERK1/2信號通路進(jìn)而抑制人肝癌HCCLM3細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其具體作用與E-cadherin表達(dá)的上調(diào)和N-cadherin表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅是在體外細(xì)胞水平研究，仍需行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，進(jìn)而為后續(xù)中草藥化合物ACT在臨床上的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。