GeneXpert MTB/RIF Ultra在肺外結(jié)核診斷中的研究進(jìn)展

董裕 張福真 尚媛媛 逄宇

肺外結(jié)核占所有結(jié)核病的15%～20%[1],它可以獨(dú)立存在,也可以與肺結(jié)核同時(shí)存在。大多數(shù)情況下,肺外結(jié)核是由肺結(jié)核直接蔓延、淋巴循環(huán)或血液傳播引起[2],主要累及腸道、腦膜、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、腎臟和皮膚等組織[3]。肺外結(jié)核的感染途徑和感染部位多樣,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,缺乏特異性診斷[4],容易與其他疾病的局部臨床癥狀混淆,導(dǎo)致誤診率和漏診率升高。由于診斷的困難和延遲,肺外結(jié)核的發(fā)病率和死亡率較高。為了滿足早期診斷的需求,臨床迫切需要能夠快速準(zhǔn)確診斷肺外結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室方法,以便配合臨床積極開展治療。

當(dāng)前肺外結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷依舊以病原學(xué)檢測(cè)為主,通過(guò)檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌菌體或其核酸。由于肺外結(jié)核的發(fā)病部位廣泛,標(biāo)本不易獲取且標(biāo)本質(zhì)量難以控制,使得病原學(xué)方法診斷肺外結(jié)核的局限性較明顯[5]。免疫學(xué)檢測(cè)方法雖然操作簡(jiǎn)便快速,敏感度和特異度較高,但是檢測(cè)結(jié)果易受機(jī)體免疫水平波動(dòng)的影響,并且還無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染或新近感染[6]。因此,開發(fā)和評(píng)估新型檢測(cè)方法在肺外結(jié)核診斷中的實(shí)際應(yīng)用是至關(guān)重要的。2017年3月,世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用超敏結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測(cè)(GeneXpert MTB/RIF Ultra,簡(jiǎn)稱“Xpert Ultra”)取代GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)[7]。Xpert Ultra作為一種快速、高敏感度的分子生物學(xué)檢測(cè)方法[8],將為肺外結(jié)核的早期快速診斷提供新的技術(shù)支撐。

Xpert Ultra的原理及現(xiàn)狀

為了提高檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度,Xpert Ultra采用了兩種不同的多拷貝擴(kuò)增靶標(biāo)(IS6110和IS1081),并采用了比Xpert更大的DNA反應(yīng)室(Xpert Ultra為50 μl PCR反應(yīng),而Xpert為25 μl)。同時(shí),Xpert Ultra還采用了全嵌套核酸擴(kuò)增技術(shù)、更快速的熱循環(huán)技術(shù),以及改進(jìn)的流體技術(shù)和酶,因而使得檢測(cè)限(limit of detection,LOD)由每毫升114個(gè)菌落形成單位(CFU)降低為16個(gè)CFU[9]。Xpert Ultra作為一種新型的診斷技術(shù),相較于Xpert具有更高的敏感度和特異度,尤其是對(duì)于少菌標(biāo)本的檢測(cè)效能有很大的提升[10]。王淑琦等[11]采用Xpert Ultra和Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv,二者均可以在樣本濃度大于200 CFU/ml 時(shí)100%判斷利福平耐藥。Xpert檢測(cè)利福平敏感度的LOD為112.6 CFU/ml(95%CI:91.9～152.8 CFU/ml),而Xpert Ultra則為105.4 CFU/ml(95%CI:78.5～178.8 CFU/ml)。相較于Xpert的檢測(cè)時(shí)間,Xpert Ultra陽(yáng)性和陰性結(jié)果的報(bào)告時(shí)間也有所縮短,可以更快速地獲得檢測(cè)結(jié)果[11]。一項(xiàng)針對(duì)成人肺結(jié)核患者的前瞻性多中心研究顯示,Xpert Ultra的診斷敏感度高于Xpert,在涂片陰性但培養(yǎng)陽(yáng)性的痰標(biāo)本中,敏感度分別為63%和46%(樣本數(shù)135份);在合并HIV感染者的培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本中,敏感度分別為90%和77%(樣本數(shù)115份)[12]?？梢? Xpert Ultra具有良好的敏感度和特異度,是一種快速診斷早期結(jié)核病的新方法。但是,Xpert Ultra對(duì)肺外結(jié)核的診斷在一定程度上受標(biāo)本類型等因素的影響,因此,需要重點(diǎn)關(guān)注并評(píng)估影響診斷效能的因素,提出解決或優(yōu)化方案以提高實(shí)驗(yàn)室診斷的準(zhǔn)確性,更有效地對(duì)肺外結(jié)核進(jìn)行防控和治療[13]。

Xpert Ultra在各類肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用

一、Xpert Ultra在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是結(jié)核感染最嚴(yán)重的一種形式,新發(fā)患者占結(jié)核病新發(fā)患者的1%～5%[14]。TBM的臨床癥狀非常嚴(yán)重,引起的腦膜炎死亡率可達(dá)50%以上[15]。對(duì)于合并HIV感染患者來(lái)說(shuō),情況更加嚴(yán)重,其死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加3倍[16]。如果早期診斷延誤,患者將無(wú)法接受最佳治療,可能導(dǎo)致殘疾或死亡[17]。因此,準(zhǔn)確的早期診斷和及時(shí)的有效治療對(duì)于挽救TBM患者的生命至關(guān)重要。

目前,診斷TBM主要通過(guò)分析患者腦脊液的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果、Xpert檢測(cè)結(jié)果及臨床癥狀進(jìn)行綜合診斷[18]。Xpert Ultra的出現(xiàn)給TBM的診斷提供了新途徑。Cresswell等[19]的研究對(duì)204例疑似腦膜炎的烏干達(dá)成年人進(jìn)行了腦脊液Xpert Ultra 檢測(cè),其中有96%的患者合并HIV感染。以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn),Xpert Ultra檢測(cè)的敏感度為76.5%(95%CI:62.5%～87.2%),優(yōu)于Xpert檢測(cè)的敏感度[55.6%(95%CI:44.0%～70.4%)]和分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度[61.4%(95%CI:45.5%～75.6%)]。但該研究是以臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)性判斷作為參考標(biāo)準(zhǔn)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,缺少說(shuō)服力,同時(shí)也缺乏對(duì)特異度這部分?jǐn)?shù)據(jù)的關(guān)注。另一項(xiàng)由Bahr等[20]利用22例TBM患者冷凍保存的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的研究,結(jié)果顯示,Xpert Ultra檢測(cè)的敏感度為95%(95%CI:77%～99%),而Xpert和分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)的敏感度均為45%(95%CI:24%～68%)。在這項(xiàng)研究中,Xpert Ultra也表現(xiàn)出優(yōu)于其他兩種檢測(cè)方法的敏感度。另外,該研究還表明低溫保存腦脊液并不影響Xpert Ultra的檢測(cè)結(jié)果,但由于標(biāo)本數(shù)量較少,仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本數(shù)來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。由Shen等[21]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃研究分析了Xpert Ultra和Xpert對(duì)601例患者腦脊液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果顯示兩者的特異度均高達(dá)100%,但是Xpert Ultra具有更高的敏感度。以上研究中,Xpert Ultra均表現(xiàn)出良好的診斷效能,但Cresswell 等[19]在HIV陽(yáng)性人群中發(fā)現(xiàn),雖然Xpert Ultra檢測(cè)TBM的敏感度高于Xpert和分枝桿菌培養(yǎng),但是Xpert Ultra的陰性似然比卻為 93%,這不足以在結(jié)果為陰性時(shí)排除TBM。

由此可見,Xpert Ultra對(duì)TBM的診斷具有一定的參考價(jià)值,但HIV患者免疫功能的受損會(huì)影響Xpert Ultra的檢測(cè)敏感度和特異度,這導(dǎo)致 Xpert Ultra在當(dāng)前實(shí)際應(yīng)用中需要篩選適用人群以滿足臨床需求,會(huì)給TBM的診斷帶來(lái)繁瑣與不便。因此,在后續(xù)研究中不僅需要優(yōu)化Xpert Ultra以提高其檢測(cè)腦脊液標(biāo)本的敏感度,還應(yīng)關(guān)注Xpert Ultra 在HIV患者等免疫受損人群中的應(yīng)用,補(bǔ)充其適用對(duì)象,增加其適用面,提高其診斷準(zhǔn)確性和可靠性。

二、Xpert Ultra在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是一種罕見的肺外結(jié)核,其發(fā)病率約占肺外結(jié)核總發(fā)病率的3%～5%[22]。最常見的受累部位是脊柱,尤其是胸腰椎,其病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為骨骼破壞和結(jié)核性肉芽組織形成[23]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷困難及治療延遲,會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[24]。

骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期臨床表現(xiàn)不典型,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和影像學(xué)檢查特異度較低,導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)結(jié)核漏診率較高[25]。Ngcelwane等[26]對(duì)55例脊柱結(jié)核患者的組織和膿液標(biāo)本進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè),47例為陽(yáng)性,其中有23例患者的組織和膿液均呈陽(yáng)性。由于研究者沒(méi)有設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,這使得研究數(shù)據(jù)參考價(jià)值有限。Sun等[27]使用Xpert Ultra對(duì)132例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的關(guān)節(jié)液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。在這些骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中,19例涂片鏡檢陽(yáng)性,52例培養(yǎng)陽(yáng)性,104例通過(guò)Xpert檢測(cè)為陽(yáng)性,120例通過(guò)Xpert Ultra檢測(cè)為陽(yáng)性。該研究中Xpert Ultra檢測(cè)的敏感度為90.91%,分別高于Xpert(78.79%)、培養(yǎng)(39.39%)和涂片(14.39%),其中Xpert Ultra在涂片陽(yáng)性標(biāo)本中的敏感度為100%,在培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的敏感度為96.15%,在同涂片法比較中,Xpert Ultra表現(xiàn)出良好的敏感度,但同作為金標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)法比較中,Xpert Ultra出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。Mekkaoui等[28]評(píng)估了Xpert Ultra對(duì)27份骨關(guān)節(jié)標(biāo)本檢測(cè)的表現(xiàn),以培養(yǎng)結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)得出Xpert Ultra的敏感度為100%,特異度為87.5%?？梢?Xpert Ultra在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,但仍需更多標(biāo)本來(lái)驗(yàn)證。

三、Xpert Ultra在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用

淋巴結(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核的常見形式之一,其中頸部淋巴結(jié)腫大最為常見,腹股溝、腋窩、腸系膜、縱隔和乳腺內(nèi)也有報(bào)道[29]。淋巴結(jié)結(jié)核的早期診斷非常困難,大多數(shù)淋巴標(biāo)本的采集需要進(jìn)行有創(chuàng)性操作[30]。Perez-Risco等[31]以培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了Xpert Ultra對(duì)25份淋巴結(jié)標(biāo)本的診斷性能,結(jié)果顯示其敏感度為94.1%,特異度為100%。Antel等[32]對(duì)73例患者甲狀腺穿刺活檢組織進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其敏感度為70%,特異度為100%。這項(xiàng)研究的結(jié)果支持在懷疑淋巴結(jié)結(jié)核的情況下,進(jìn)行超聲引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺抽吸活檢,并進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè),以便在微創(chuàng)、高敏感的條件下快速獲得診斷結(jié)果。同時(shí),Mekkaoui等[28]的研究已經(jīng)證明Xpert Ultra對(duì)HIV流行環(huán)境中淋巴結(jié)結(jié)核的診斷具有高度敏感性。這項(xiàng)研究報(bào)告了以培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn),Xpert Ultra對(duì)196例患者甲狀腺穿刺活檢組織的敏感度和特異度分別為95.8%和81.6%。盡管淋巴結(jié)結(jié)核的診斷通常需要有創(chuàng)性檢查,但在配合Xpert Ultra這種高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法下表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷能力,因此,應(yīng)盡快推動(dòng)其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用,從而提高淋巴結(jié)結(jié)核的早期診斷效率和治療效果。

四、Xpert Ultra在泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核診斷中的應(yīng)用

泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核是肺外結(jié)核的一種常見形式,約占肺外結(jié)核患者的5%～40%[33]。該疾病可以發(fā)生在各個(gè)年齡段,但主要發(fā)生在四五十歲的男性身上。泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核是一種嚴(yán)重的潛在疾病,通常在晚期才出現(xiàn)癥狀,出現(xiàn)診斷延誤,并可能導(dǎo)致泌尿生殖器官的損傷[34]。目前,只有少數(shù)研究關(guān)注使用Xpert Ultra來(lái)評(píng)估尿液診斷泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核的效果。Perez-Risco等[31]以培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估了Xpert Ultra對(duì)24份尿液標(biāo)本的診斷性能,結(jié)果顯示其敏感度為100%,特異度為100%。另一項(xiàng)研究分析了少量尿液樣本,并將Xpert Ultra的結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其敏感度為100%[35]。這些研究結(jié)果均表明,Xpert Ultra在泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核的診斷中表現(xiàn)出良好的性能,可以作為一種高效、準(zhǔn)確的診斷方法。然而,目前相關(guān)研究仍然較少,Xpert Ultra在泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值仍需要深入探討。

總結(jié)與展望

作為世界衛(wèi)生組織推薦的用于肺外結(jié)核診斷的分子診斷技術(shù),Xpert Ultra盡管在肺外結(jié)核的診斷中發(fā)揮重要作用,但是Xpert Ultra仍然存在一些局限性。首先,Xpert Ultra的敏感度提高在一定程度上會(huì)影響其診斷特異度[11];其次,作為一種基于PCR的檢測(cè)技術(shù),Xpert Ultra仍無(wú)法區(qū)分活菌和死菌[36],因此,在具有結(jié)核病病史的患者中的診斷局限性明顯。同時(shí),Xpert Ultra的診斷效能還受限于不同類型的肺外結(jié)核標(biāo)本。在分析感染部位體液時(shí),Xpert Ultra在腦脊液和骨關(guān)節(jié)積液中表現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值,可以為臨床前期診斷和抗結(jié)核治療給予指導(dǎo)作用。此外,Xpert Ultra在淋巴結(jié)結(jié)核的淋巴組織活檢中表現(xiàn)出良好的敏感度和特異度,可以為淋巴結(jié)結(jié)核的診斷提供新方式。盡管Xpert Ultra在尿液檢測(cè)中的標(biāo)本數(shù)量較少,但已經(jīng)表現(xiàn)出良好的診斷效能。目前相關(guān)研究仍然相對(duì)較少,需要進(jìn)一步挖掘Xpert Ultra在肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

隨著免疫缺陷和免疫受損人群比例的增加,肺外結(jié)核的感染風(fēng)險(xiǎn)也在上升。肺外結(jié)核的臨床癥狀缺乏特異性,使得診斷具有挑戰(zhàn)性。此外,Xpert Ultra的診斷效能受到感染部位、標(biāo)本類型、標(biāo)本質(zhì)量和HIV感染等因素的影響,需要完善肺外結(jié)核的標(biāo)本選擇體系,建立規(guī)范的標(biāo)本采集和檢測(cè)流程,評(píng)估其對(duì)不同人群的適用性,優(yōu)化其能適應(yīng)復(fù)雜的診斷環(huán)境。另外,Xpert Ultra作為一種高成本檢驗(yàn)方法,在資源匱乏的環(huán)境中難以廣泛應(yīng)用,尤其對(duì)于結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家而言。因此,Xpert Ultra在肺外結(jié)核中盡管表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷價(jià)值,仍需要進(jìn)一步改良和優(yōu)化,使其兼顧普遍適用性和經(jīng)濟(jì)實(shí)用性,以便更廣泛地應(yīng)用于肺外結(jié)核的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)董裕:起草文章;張福真和尚媛媛:對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱;逄宇:對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、行政/技術(shù)/材料支持、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn)