春黃菊干花特征香氣成分鑒定及香氣協(xié)同作用變化評估

徐志強，熊文，馮俊俏，牛云蔚

（1.煙草化學安徽省重點實驗室,安徽合肥 230088）（2.云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南昆明 650231）（3.焦甜香生物科技有限公司，安徽蕪湖 241000）（4.上海應(yīng)用技術(shù)大學香料香精化妝品學部，上海 201418）

春黃菊是菊科草本植物，原產(chǎn)于歐洲中部，現(xiàn)我國的西北、東北、西南等地均有種植[1]。春黃菊有三種不同產(chǎn)地的品種，包括德國春黃菊、羅馬春黃菊、摩洛哥春黃菊。根據(jù)產(chǎn)地的不同，不同的春黃菊中化學成分含量有很大差異，其中，德國春黃菊中揮發(fā)油含量要高于羅馬春黃菊，羅馬春黃菊中揮發(fā)油主要成分為當歸酸和惕各酸的脂肪族酯，而德國春黃菊油主要成分為沒藥醇及其氧化物。羅馬洋甘菊具有抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗炎、催奶等作用[2-5]，其揮發(fā)油對抑郁癥、牙周炎有較好的效果[6,7]。而德國春黃菊在歐洲用得較廣，被稱為歐洲的萬靈藥。它具有殺菌和殺真菌、催眠，助消化，緩解關(guān)節(jié)腫痛等作用[8,9]。

目前，對春黃菊干花的生物特性、藥學性能的研究較多，關(guān)于春黃菊干花和精油香氣成分的報道相對較少，且多集中于羅馬春黃菊精油揮發(fā)性成分組成分析[10,11]，而對于德國春黃菊的揮發(fā)性成分研究基本沒有。李斌等[12]采用GC-MS技術(shù)，分析洋甘菊花精油成分，主要含有母菊薁，母菊素，反式-β-法尼烯，α-甜沒藥萜醇及其氧化物，雙環(huán)吉馬烯，香芹酮等。韓松林[13]采用GC測定，以紅沒藥醇為對照品，測定洋甘菊花精油含紅沒藥醇衍生物（紅沒藥醇氧化物，紅沒藥醇氧化物A，紅沒藥醇氧化物B，紅沒藥醇）質(zhì)量分數(shù)約0.01%~0.04%。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），應(yīng)用于醫(yī)學、物理學，氣相色譜的流動相為惰性氣體，其主要原理為氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相，當多組分的混合樣品進入色譜柱后，由于吸附劑對每個組分的吸附力不同，從而達到分離各組分的功效。氣相色譜-嗅聞技術(shù)（GC-O）是將嗅覺和儀器檢測結(jié)合起來的分析技術(shù)，將經(jīng)過前處理的樣品注入到連有氣味檢測儀的色譜柱中，通過FID或MS檢測器檢測樣品的化學組成，獲得樣品的化學組成和氣味特征信息。

實驗通過GC-MS分析鑒定了德國春黃菊干花中的揮發(fā)性香氣成分，并結(jié)合GC-O香氣強度法研究了對春黃菊整體香氣貢獻較大的香氣物質(zhì)為(E)-β-金合歡烯、乙酸和甜沒藥烯萜醇氧化物B，確定了關(guān)鍵香氣成分戊酸和癸酸乙酯，結(jié)論為春黃菊的應(yīng)用提供理論依據(jù)，進一步提升春黃菊相關(guān)食品的生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

春黃菊樣品產(chǎn)地，安徽省宣城市楊柳鎮(zhèn)；2-辛醇、乙醇、正構(gòu)烷烴（C7~C30），Sigma-Aldrich西格馬奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890-MS5973氣-質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；固相微萃取纖維涂層（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國Supelco公司；ODP-2嗅聞儀，德國Gerstel公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品準備

稱取1 g包含春黃菊干花的花柄和花瓣的樣品加入試劑瓶中，再用移液器吸取100 μL內(nèi)標2-辛醇（內(nèi)標，40 mg/L）。

1.3.2 頂空固相微萃?。℉S-SPME）

將萃取頭在250 ℃老化20 min，以確保其在吸附之前沒有殘留物。將 1 g春黃菊和 100 μL 2-辛醇（40 mg/L，內(nèi)標）放于20 mL頂空瓶中。然后，將頂空瓶置于 50 ℃恒溫水浴鍋中。將萃取頭置于樣品的頂部空間吸附30 min（距離樣品表面上方約1 cm），結(jié)束后，插入GC-MS進樣口，解析5 min，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進行分析。

1.3.3 GC-MS分析

GC條件：DB-5非極性色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣流速：2 mL/min；載氣：氦氣；升溫程序：維持 6 min的初始溫度 40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，維持20 min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：不分流。

MS條件：電子轟擊能量：70 eV；采用EI電離源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：250 ℃；全掃描范圍：30~350m/z。

1.3.4 GC-O

GC-O在配備有嗅覺檢測端口Gerstel ODP-2的Agilent 7890氣相色譜（GC）上進行。GC流出物在氫離子火焰檢測器（FID）和嗅聞口之間以1:1的比例分開。載氣（氫氣）的流速為2 mL/min。柱箱溫度從40 ℃（6 min），3 ℃/min 升至 100 ℃，然后以 5 ℃/min升溫至230 ℃（20 min），噴射器和FID溫度分別設(shè)定在250 ℃和280 ℃。潮濕空氣以50 mL/min的速度進入嗅聞口，為專業(yè)的嗅聞小組成員提供舒適感。

由來自上海應(yīng)用技術(shù)大學香料香精化妝品學部的3名的專業(yè)人員，感知并記錄香氣化合物的保留時間、香氣強度以及香氣描述。實驗運用“時間強度法”以0~10分的十分制來評定香氣強度：“0”表示無；“2”表示香氣強度較弱；“4”表示香氣強度弱；“5”表示香氣強度中等；“7”表示香氣強度強；“9”表示香氣強度非常強。每人嗅聞3次，最后記錄的香氣強度采用嗅聞人員的平均值。

1.3.5 香氣活力值（OAV）

對各香氣物質(zhì)定量后，根據(jù)參考文獻[14]中的氣味閾值，計算OAV，見公式（1）。

式中：

C——香氣化合物的濃度；

OT——香氣閾值[15]。

利用 OAV值評估揮發(fā)性化合物對春黃菊樣品風味特征的重要性，當OAV≥1時，則該組分被認為對整體香氣有重要貢獻。

1.3.6 S曲線法

利用Origin軟件，根據(jù)S曲線方程（公式2）進行擬合。當嗅覺檢測概率為0.5時，對應(yīng)的是待測組分的檢測閾值[16-22]。二元混合物的理論檢測概率使用Feller加合模型，如香氣化合物A和香氣化合物組成的二元混合物，混合后的理論檢測概率根據(jù)Feller加合公式（公式 3）計算得到，當實驗閾值與理論閾值的比值R＞1時，則表現(xiàn)出掩蓋作用；當R=1時，則為折中作用，當I＞R＞0.5時，則為加成作用；當R≤0.5時，則為協(xié)同作用。

式中：

P——嗅覺檢測概率；

t——待測組分的嗅覺閾值；

x——待測組分的濃度對數(shù)值；

P——校后的嗅覺檢測概率；

D——每種待測組分的參數(shù)特征，即函數(shù)的陡度。

P(AB)——檢測混合物的理論嗅覺檢測概率；

P(A)——香氣化合物A的嗅覺檢測概率；

P(B)——香氣化合物B的嗅覺檢測概率。

1.3.7 電子鼻

采用配備MXT-5（10 m×0.18 mm×0.4 μm，美國）MXT-1701（10 m×0.18 mm×0.4 μm，Restek，美國）色譜柱的Alpha M.O.S HERACLES II電子鼻（AlphaMO，法國）直接將稱量好的混合樣品進行靜態(tài)頂空分析。

1.3.8 感官分析

樣品的評估使用九分制（0=無，9=極強）。首先，小組成員收集春黃菊的描述性術(shù)語；其次，小組成員討論不同的感官屬性標準，并選擇了有關(guān)春黃菊的五種香韻描述詞（花香、青香、藥香、木香和果香）找到 10名相關(guān)專業(yè)的研究生進行進一步的定量描述分析，由實驗人員在旁記錄結(jié)果并確定各個香韻的香氣強度標準。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016版本進行原始數(shù)據(jù)處理，Origin 2021進行分析及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 春黃菊香氣成分的定性定量分析

參照李愛萍等[23]的研究方法用氣相-質(zhì)譜儀對杭白菊花水的香氣成分進行分析。對春黃菊進行了GC-MS與GC-O分析，通過質(zhì)譜、RI值、香氣特征對其進行了鑒定，一共檢測出53種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類13種，醛類6種，醇類8種，酸類6種，酮類2種，烯烴類11種，其它類7種。表1為通過GC-MS與GC-O分析獲得的香氣化合物的濃度、香氣特征。由表1可知，主要香氣化合物是(E)-β-金合歡烯（6.06 mg/L），乙酸（4.61 mg/L），甜沒藥烯萜醇氧化物B（1.12 mg/L）和癸酸乙酯（0.75 mg/L）。

表1 春黃菊干花香氣成分、含量及OAVTable 1 Aroma components, content and OAV of dried Chamomile

香氣化合物的含量不是評價其在樣品中貢獻的唯一標準，往往還要參考它們的香氣閾值。根據(jù)Guth獲得的結(jié)果，OAV大于1的香氣化合物被認為有助于樣品的香氣。根據(jù)HS-SPME-GC-MS的定性、定量結(jié)果，并用查找到的對應(yīng)閾值計算其OAV值，由表2可知，計算出有18種香氣化合物OAV＞1.00，其中酯類8種、酸類6種、醛類2種、醇類1種、醚類1種。8種酯類化合物分別為癸酸乙酯、癸酸甲酯、苯甲酸甲酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、壬酸乙酯，酯類化合物雖然數(shù)量最多，但是其濃度卻占12.00%，是春黃菊中第三大種類的物質(zhì)，其中癸酸乙酯OAV值最大（622.43），表現(xiàn)為果香、脂蠟香、甜香；6種酸類化合物分別為戊酸、乙酸、己酸、異戊酸、2-甲基丁酸、丙酸，值得注意的是，酸類化合物雖然只有6種化合物，但其濃度卻占29.77%，是酯類化合物含量的兩倍，是春黃菊中第二大種類的物質(zhì)，其中戊酸OAV值最大（1 096.01），表現(xiàn)為酸臭味，其他酸類的OAV值也都大于5，對春黃菊香氣有很大貢獻；2種醛類化合物分別為苯甲醛、壬醛，它們主要貢獻于青香、脂蠟香、花果香；醇類化合物是桉葉油醇，表現(xiàn)為藥草香；醚類化合物是玫瑰醚，表現(xiàn)為花香。徐曉俞[24]等對杭白菊花水香氣成分進行分析，實驗數(shù)據(jù)得到的酯類、烯烴類、酮類相對含量較高，而本次實驗中鑒定出酸類成分比較高，推測可能是因為本次實驗的研究對象是干花，與空氣接觸時間較長。當然，這些成分的共同作用構(gòu)成了春黃菊干花的濃郁香氣[25]。

戊酸、癸酸乙酯、乙酸的OAV在樣品中大于150，因此被認為是春黃菊中主要的香氣化合物，其中戊酸

是樣品中 OAV值最高的香氣化合物，對春黃菊的酸香有很大貢獻。有7種化合物的OAV值在10~150之間，如癸酸甲酯、苯甲酸甲酯、己酸乙酯、己酸。它們主要貢獻于果香、甜香、花香、酒香和酸香，可能促進春黃菊整體香氣的和諧。比如錢海峰[26]實驗中菊花樣品的己酸乙酯含量略低于本實驗，所以春黃菊樣品的果香尤為突出；郭雙[27]對四種菊花進行分析，其中所有樣品的(E)-β-金合歡烯均遠低于本實驗春黃菊樣品的含量，因(E)-β-金合歡烯的香氣描述為藥草香、木香和甜香，所以本實驗樣品在藥草香、木香和甜香中均有體現(xiàn)；其中苯甲酸甲酯含量為0.06 mg/L，香氣強度為4.98，不被認為是重要的香氣化合物，但是由于其極低的閾值，導致 OAV值較高，對春黃菊的香氣有很大貢獻。本實驗數(shù)據(jù)顯示春黃菊樣品中芳樟醇的含量略高于薛建[28]對野扇花的香氣分析實驗的數(shù)據(jù)，所以樣品在花香的感官中非常明顯。

續(xù)表1

2.2 感官描述性分析

實驗中對春黃菊進行感官評價，并對“花香”、“果香”、“甜香”、“青香”、“酸香”、“木香”和“藥草香”7個香韻指標進行綜合打分，春黃菊的感官分析結(jié)果如表2和圖1所示。香韻得分最高的是花香香韻，其次是酸香、果香香韻，青香強度較弱，感官分析結(jié)果與春黃菊的香氣特征是一致的?；ㄏ阆沩嵖赡芘c酯類、醚類和醇類香氣物質(zhì)有關(guān)，酸香與酸類香氣物質(zhì)有關(guān)。

表2 春黃菊干花感官分析結(jié)果Table 2 Sensory analysis results of dried chamomile

圖1 春黃菊的香氣輪廓Fig.1 The aroma profile of Chanmomile

滕云[29]測得用無溶劑微波萃取法提取野菊花精油中的桉油烯醇同本實驗測得的含量相差不多，但本實驗數(shù)據(jù)顯示春黃菊樣品中樟腦、石竹烯這些具有藥草香、木香、青香香氣的化合物比潘蕓蕓[30]等測定四種食用菊花中的含量都略低，且其測得的四種食用菊花中所含有的主要相同成分1,8-桉葉油素、α-蒎烯等，這些具有藥草香青、香香氣的化合物本實驗都沒有測得，肖作兵[31]等對7個廠家的菊花精油中桉葉油醇測得得數(shù)據(jù)也比本實驗略高。故樣品在藥草香的感官中不是特別突出。

除感官評價外，還對春黃菊干花樣品進行了電子鼻分析，如圖2所示，這兩個圖分別表示由兩個不同極性的毛細管柱（包括MXT-5和MXT-1701）和兩個FID檢測到的香氣化合物的輪廓。建立了春黃菊干花的風味指紋圖譜，為今后的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

圖2 春黃菊的電子鼻分析Fig.2 Electronic nose analysis of Chamomile

2.3 S型曲線法

根據(jù)春黃菊香氣成分中OAV和GC-O測定結(jié)果，并結(jié)合感官分析，選擇己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯4種酯類香氣化合物和乙酸、戊酸2種酸類香氣化合物進行研究，采用S型曲線法探究不同結(jié)構(gòu)香氣成分之間的相互作用關(guān)系，總結(jié)春黃菊主要香韻的香氣成分之間協(xié)同效應(yīng)的關(guān)系。

為了更好地深入研究果香和酸香香氣成分之間的相互作用關(guān)系，根據(jù)Feller添加模型將獲得的數(shù)據(jù)與計算的理論值進行比較從而評估每個酯類物質(zhì)對于混合物香氣的影響。通過S曲線法確定酯類和酸類物質(zhì)的香氣閾值（結(jié)果見圖3和表3）。如表3所示，己酸乙酯和苯甲酸甲酯的香氣閾值為0.47和22.76 mg/L，辛酸乙酯和癸酸乙酯的香氣閾值為71.90和2.53 mg/L，乙酸和戊酸的香氣閾值為63.02和0.02 mg/L。且由表格中可以看出，擬合方程的回歸系數(shù)都是大于0.90，說明S型曲線擬合效果好。

表3 酯類和酸類混合物理論閾值與實測閾值Table 3 Theoretical and measured thresholds for mixtures of esters and acids

圖3 2種酸類和4種酯類的閾值S曲線圖Fig.3 Threshold S-curves of two acids and four esters

測定酯類和酸類混合物的閾值按照混合物中下香氣化合物在春黃菊中實際濃度比例混合。從表3中可以看出，酸香和果香香氣成分組合時，原有香氣物質(zhì)的閾值都發(fā)生了改變，即兩個香氣物質(zhì)混合后的實測閾值和理論閾值存在偏差，結(jié)果表明這些香氣物質(zhì)混合時，發(fā)生了相互作用。香氣物質(zhì)間的相互作用通過試驗閾值與理論閾值的比值判定，該比值為R，R＞1，表現(xiàn)為掩蓋作用；R=1，無作用；0.5＜R＜1，加成作用；R≤0.5，協(xié)同作用[32]。

從上面的研究內(nèi)容可以看出，S型曲線法綜合了香氣成分的閾值、濃度等因素的相互作用，彌補了閾值法的局限性[33]。通過S曲線法和Feller添加模型得出的辛酸乙酯和乙酸混合物的實際香氣閾值和理論香氣閾值為71.895 2和63.020 2 mg/kg（見圖3和表3）。辛酸乙酯和乙酸混合物的實際閾值與其理論閾值的比值為0.48。辛酸乙酯和乙酸有明顯的協(xié)同作用。實驗測試了關(guān)鍵酯類化合物和酸類化合物的八組二元混合物（圖4和表3）。根據(jù)表3，八對二元混合物的實驗檢測概率，幾乎占一半以上（62.5%），低于Feller添加模型計算得出的理論值，由此得出這八對混合物具有掩蓋效果。這些混合物是乙酸和苯甲酸甲酯，乙酸和己酸乙酯，戊酸和苯甲酸甲酯，戊酸和己酸乙酯，戊酸和辛酸乙酯。其中，朱建才[34]通過S型曲線法、OAV法、σ-τ圖法也發(fā)現(xiàn)乙酸和己酸乙酯有強烈的掩蓋作用。此外，2對混合物的實驗檢測概率大于使用Feller添加模型計算的值，揭示了加成作用效果。這些混合物是乙酸和癸酸乙酯，戊酸和癸酸乙酯。由此可以看出，癸酸乙酯可能和酸香具有加成作用。因香氣成分之間存在著復雜的協(xié)同、掩蓋和加成等作用[35]，從S型曲線法的總體結(jié)果看出，果香和酸香的香氣成分之間更容易表現(xiàn)出掩蓋作用，這個結(jié)論與朱建才[34]通過S曲線、香韻主導性研究得到的結(jié)論相似，果香和酸香之間發(fā)生的掩蓋作用也讓春黃菊的酸香香氣比較柔和，使得春黃菊整體香氣豐富但又協(xié)調(diào)。

圖4 S曲線法分析8組混合物質(zhì)香氣協(xié)同F(xiàn)ig.4 S-curve method to analyze aroma synergy of 8 groups of mixed substances

3 結(jié)論

通過對春黃菊干花樣品進行GC-MS與GC-O分析，共鑒定出53種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類（13種）、萜烯類（11種）、醇類（8種）、醛類（6種）、酸類（6種）、酮類（2種）和其他類（7種），萜烯類香氣物質(zhì)是春黃菊樣品揮發(fā)物中含量最大的化學組分（42.68%）。而通過GC-O和OAV實驗得出，春黃菊樣品的主要香氣化合物是(E)-β-金合歡烯（6.06 mg/L），乙酸（4.61 mg/L），甜沒藥烯萜醇氧化物B（1.12 mg/L）和癸酸乙酯（0.75 mg/L）。根據(jù)HS-SPME-GC-MS的定性、定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OAV＞1.00的香氣化合物有18種，包括酯類（8種）、酸類（6種）、醛類（2種）、醇類（1種）和醚類（1種）。

根據(jù)春黃菊香氣成分中GC-MS和GC-O測定結(jié)果，選擇己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯4種酯類香氣化合物和乙酸、戊酸2種酸類香氣化合物進行研究，采用S曲線法評估了兩類化合物之間的相互作用。結(jié)果表明，乙酸與苯甲酸甲酯和己酸乙酯發(fā)生掩蓋作用，與辛酸乙酯發(fā)生協(xié)同作用，與癸酸乙酯發(fā)生加成作用；而戊酸除與癸酸乙酯發(fā)生加成作用外，與其他物質(zhì)均發(fā)生掩蓋作用。綜上春黃菊在日常生活中可用于日化品、食品、酒類和煙草調(diào)香中[36]。