不同提取方法的蓮子心多糖結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)比較

方嘉沁，鄭青松，文雨欣，鄭丹純，陽運(yùn)軍，翟永貞，張霞,3，李冰,3*

（1.廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東廣州 511442）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640）（3.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

天然活性化合物如多糖、多酚類物質(zhì)等都具有較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)及多種疾病的治療中[1-3]?！吨袊幍洹肥珍浻涊d：蓮子心具有清心火、平肝火、清心安神等作用。蓮子心作為蓮加工的副產(chǎn)物對其所含活性物質(zhì)的開發(fā)利用程度不高。蓮子心多糖是蓮子心中的主要化學(xué)成分之一，具有抗氧化、降血糖等作用，是很有應(yīng)用前景的活性功能因子。目前關(guān)于蓮子心多糖的提取方法主要局限于熱水浸提，存在提取效率偏低等問題。

植物多糖的提取方法包括傳統(tǒng)的熱水浸提法以及其他輔助提取技術(shù)，傳統(tǒng)熱水浸提法具有條件溫和、不破壞多糖結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)會(huì)消耗大量成本和時(shí)間，且提取效率不夠高。其他輔助提取方法包括酶輔助提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、脈沖電場輔助提取、超臨界流體輔助提取等，各自具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。在眾多新穎的輔助提取方法中，超聲輔助提?。║AE）、酶輔助提?。‥AE）和微波輔助提?。∕AE）是天然活性產(chǎn)物提取目前最常見的方法。已有文獻(xiàn)表明，多糖的生物活性與其分子量、單糖組成、糖醛酸含量以及空間構(gòu)型等有關(guān)[4-6]。提取方法的不同對多糖得率、多糖純度、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、功能特性以及生物活性都會(huì)造成一定的影響[7]。目前對于不同提取方法對蓮子心多糖得率、含量、理化性質(zhì)以及功能特性的影響尚不明晰。

因此，本研究分別采用超聲輔助提取（UAE）、酶輔助提取（EAE）、微波輔助提?。∕AE）和傳統(tǒng)熱水浸提法（HWE）提取蓮子心多糖，考察不同方法對蓮子心多糖得率、純度、理化性質(zhì)以及功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥蓮子心，由湘潭蓮子生產(chǎn)基地提供。利用小型中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到蓮子心粉末備用。乙醇、苯酚、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、牛血清白蛋白、葡萄糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

XL-20B高速中草藥粉碎機(jī)，廣州旭朗有限公司；Milestone Ethos微波萃取儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；KQ5200DE超聲波清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司；3-30KS高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司；Wizard2.0真空冷凍干燥機(jī)，美國VirTis公司；Carry 50紫外可見分光光度計(jì)，美國 Varian公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；Vertex33紅外光譜儀，德國 Bruker公司；JSM-7001F掃描電子顯微鏡，JEOL，Japan；1525GPC高效凝膠滲透色譜儀，美國 Waters公司；MOS-450圓二色譜儀，法國Biologic公司；STA449F3同步熱分析儀，德國耐馳公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將蓮子心粉末用乙醇在室溫下浸泡3次，每次12 h，以除去部分脂溶性小分子物質(zhì)、色素等雜質(zhì)，最后將浸泡后的蓮子心粉末用 40 ℃烘箱烘干，裝入自封袋保存于干燥皿中備用。

1.2.2 蓮子心多糖的提取

（1）熱水浸提：取預(yù)處理之后的蓮子心粉末，以蒸餾水為提取溶劑。參考He等[8]的方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。設(shè)定提取溫度為90 ℃，料液比為1:25（g/mL），提取次數(shù)為3次，收集3次提取液，得到蓮子心多糖熱水浸提液。

（2）超聲波輔助提?。簠⒄誝ing等[9]的方法，取預(yù)處理之后的蓮子心粉末，以蒸餾水為提取溶劑。設(shè)定超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為40 min，提取溫度為60 ℃，料液比為1:25（g/mL），提取3次，并收集提取液，得到蓮子心多糖超聲輔助提取液。

（3）微波輔助提取：參照Hu等[10]的方法，做適當(dāng)改進(jìn)，以蒸餾水為提取溶劑。設(shè)定微波功率為600 W，微波時(shí)間為3 min，料液比為1:25（g/mL），提取3次，收集提取液，得到蓮子心多糖微波輔助提取液。

（4）酶輔助提?。簠⒄誈uo等[11]的方法，以纖維素酶、果膠酶和蛋白酶復(fù)合酶法輔助提取，以蒸餾水為提取溶劑。纖維素酶、果膠酶和蛋白酶以 1:1:1的質(zhì)量比例復(fù)配，酶添加量為1%（m/m），酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間30 min，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間1 h。收集提取液，得到蓮子心多糖酶輔助提取液。

1.2.3 醇沉

對四種方法得到的蓮子心多糖提取液分別進(jìn)行除雜和濃縮。首先，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6 000 r/min離心5 min，取上清液，抽濾（0.45 μm的水系膜），進(jìn)一步除去微小固體雜質(zhì)。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對所得到的蓮子心多糖提取液進(jìn)行濃縮。濃縮至粘稠狀之后，加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃條件下，放置12 h，之后6 000 r/min離心 5 min，取沉淀，用蒸餾水復(fù)溶得到對應(yīng)蓮子心多糖溶液。

1.2.4 除蛋白

取蓮子心多糖溶液，采用 Sevage法除蛋白，按4:1的體積比加入Sevage試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1），離心（3 000 r/min，2 min），取上清，重復(fù)操作5次。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的有機(jī)試劑，蒸餾水透析36 h（3 500 u透析袋）。最后冷凍干燥得到不同方法所對應(yīng)的除蛋白后的蓮子心多糖粉末：熱水浸提蓮子心多糖（PNPHWE）、超聲波輔助提取蓮子心多糖（PNPUAE）、微波輔助提取蓮子心多糖（PNPMAE）、酶輔助提取蓮子心多糖（PNPEAE）。

1.2.5 多糖得率與純度

利用苯酚-硫酸法對多糖的含量進(jìn)行測定[12,13]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品多糖得率與純度（見公式1和2）。

式中：

A——多糖得率，%；

B——多糖純度，%；

M0——利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品中多糖質(zhì)量，g；

M1——多糖的質(zhì)量，g；

M2——樣品的質(zhì)量，g。

1.2.6 蛋白含量

參考 Cortes-Rios等[14]的方法，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，利用 BCA試劑盒測定四種樣品中蛋白含量。

1.2.7 糖醛酸含量

參考王文平等[15]的方法，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，使用咔銼-硫酸法測定蓮子心多糖的糖醛酸含量。

1.2.8 分子量的測定

參考 Ren等[16]的方法，采用高效凝膠滲透色譜（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）測定不同方法得到的蓮子心多糖的分子量分布。分別稱取10 mg多糖樣品，充分溶解于10 mL的磷酸二氫鉀緩沖溶液（0.02 mol/L），用0.22 μm的水系濾膜過濾之后進(jìn)行色譜分析。以普魯蘭系列葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品（Mw：5 200 u、11 600 u、23 800 u、48 600 u、148 000 u、273 000 u、410 000 u、668 000 u）。色譜分離條件如下：儀器型號：Waters ACQUITY APC；色譜柱：Waters ACQUITY APCTM AQ900（4.6 mm×150 mm，2.5 μm）、Waters ACQUITY APCTM AQ450（4.6 mm×150 mm，2.5 μm）、Waters ACQUITY APCTM AQ125（4.6 mm×150 mm，2.5 μm），3根色譜柱串聯(lián)；流動(dòng)相：100 nmol/L NaNO3，流量：0.4 mL/min，柱溫：35 ℃，示差折光檢測器（RID），檢測器溫度：35 ℃。以出峰時(shí)間為橫坐標(biāo)，普魯蘭分子量的對數(shù)（logMw）為縱坐標(biāo)，利用 HPGPC軟件擬合得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖的分子量。

1.2.9 單糖組成測定

參考Chen等[17]的方法，采用高效液相色譜（HPLC）測定不同方法得到的蓮子心多糖的單糖組成。

（1）樣品的水解

取10 mg多糖樣品放入高溫高壓管密封試管，加入2 mL三氟乙酸（TFA 4 mol/L），混合均勻后，110 ℃油浴4 h，之后在甲醇輔助下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，得到水解后的多糖樣品。

（2）樣品的衍生化反應(yīng)

水解后的多糖樣品溶于 200 μL的 NaOH（0.3 mol/L），加入200 μL的PMP（0.5 mol/L）70 ℃反應(yīng)1 h，加入200 μL的HCl（0.3 mol/L）進(jìn)行中和，之后用三氯甲烷反復(fù)萃取除去 PMP，最后取上清過0.22 μm的有機(jī)膜，放進(jìn)樣瓶。單糖標(biāo)準(zhǔn)品的柱前衍生化也按上述步驟進(jìn)行。

（3）高效液相色譜檢測

采用美國Waters生產(chǎn)的2998 HPLC進(jìn)行檢測，色譜柱為C18柱（Waters，4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃，流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.9）和乙腈（83:17），流速：1 mL/min，檢測波長為 245 nm。

1.2.10 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定

紅外光譜的測定采用KBr壓片法，取少量多糖樣品與適量的KBr干燥粉末混合，充分研磨，然后壓片，放入紅外光譜儀進(jìn)行掃描，掃描區(qū)間為400~4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.11 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

取少量多糖樣品，放置于樣品臺(tái)，在真空噴鍍儀中噴金處理后，進(jìn)行掃描電鏡分析，掃描電子顯微鏡為JSM-7001F（JEOL，Japan），在加速電壓10.00 kV下觀察樣樣品表面形貌。

1.2.12 圓二色譜（CD）分析

參考 Chen等[18]的方法，用圓二色譜儀對不同提取方法得到的蓮子心多糖的圓二色光譜進(jìn)行測定，配制0.5 mg/mL的多糖樣品，掃描條件為：掃描速率為100 nm/min，縫隙寬度1 nm，時(shí)間常數(shù)1 s，掃描波長范圍190~260 nm，掃描次數(shù)3次。

1.2.13 熱穩(wěn)定性分析

對蓮子心多糖進(jìn)行熱重分析（TG）和差示掃描量熱分析（DSC）測定[19]。稱取10 mg的多糖樣品置于樣品托盤中，使用N2作為實(shí)驗(yàn)氣流，流速為30 mL/min，溫度從室溫以10 ℃/min的速度升到500 ℃。

1.2.14 流變性質(zhì)測定

（1）穩(wěn)態(tài)流變學(xué)特性的測定參考Yang等[20]的方法，在25 ℃下，利用流變儀測定不同方法得到的蓮子心多糖的穩(wěn)態(tài)流變學(xué)特性，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，剪切速率為：0.1~1 000 s-1，測定時(shí)間為15 min條件下，測定不同剪切速率下蓮子心多糖的表觀粘度。在樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，溫度為：20~80 ℃，剪切應(yīng)力為2 Pa，加熱速度為6 ℃/min條件下，測定溫度變化對表觀粘度的影響。

（2）動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的測定參考Xu等[21]的方法，在 25 ℃下，對蓮子心多糖的動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性進(jìn)行測定，樣品濃度為2%，震動(dòng)頻率為1~100 rad/s，然后固定應(yīng)變?yōu)?%，溫度為25 ℃條件下，考察頻率變化對損耗模量和儲(chǔ)存模量的影響。

1.2.15 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

以上所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并使用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對多糖得率與基本組成的影響

多糖得率和純度是評價(jià)提取方法優(yōu)劣最為重要和直接的考察指標(biāo)。表1為四種不同提取方法對蓮子心多糖得率、多糖純度、蛋白含量、糖醛酸含量等的影響。多糖得率從高到底的順序?yàn)椋篗AE＞EAE＞UAE＞HWE，三種輔助提取方法均能夠提高蓮子心多糖得率，其中微波輔助提取方法多糖得率最高。多糖純度從高到底的順序?yàn)椋篜NPMAE＞PNPUAE＞PNPEAE＞PNPHWE，與多糖得率相同，三種輔助提取方法均提高了樣品中的多糖純度，同樣 PNPMAE的多糖純度為最高。超聲輔助法是利用超聲的空化等效應(yīng)促使多糖從植物細(xì)胞中擴(kuò)散出來。微波輔助法是利用微波的“內(nèi)加熱”方法加促細(xì)胞內(nèi)多糖擴(kuò)散，且當(dāng)細(xì)胞內(nèi)水等極性介質(zhì)受熱膨脹到一定程度，會(huì)使細(xì)胞破裂，更有利于多糖的滲出。酶輔助法是根據(jù)細(xì)胞壁的組成，使用相應(yīng)的酶破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而利于細(xì)胞壁多糖和細(xì)胞內(nèi)多糖的釋放。因此，與傳統(tǒng)熱提取方法相比，三種輔助方法都可以大大提取多糖的得率與提取率，而微波對植物細(xì)胞的破裂作用，更利于多糖的滲出。

表1 不同方法得到的蓮子心多糖的得率及基本組成Table 1 Chemical characteristics of crude PNP prepared by different methods

Sevage法是一種較為溫和的除蛋白方法，能夠減少多糖結(jié)構(gòu)的破壞，但存在不能完全除去蛋白和多糖損失率較高的缺點(diǎn)。經(jīng)過相同次數(shù)的除蛋白操作后，經(jīng)蛋白含量測定表明，四種多糖樣品均仍含有少量蛋白，含量從高到底順序?yàn)椋篜NPEAE＞PNPMAE＞PNPHWE＞PNPUAE。酶輔助法中含用蛋白酶，蛋白酶對植物細(xì)胞壁、膜上的蛋白以及細(xì)胞內(nèi)蛋白都有一定的水解作用，這些蛋白也溶于提取液中，所以，雖然經(jīng)過除蛋白的處理，但相比之下，酶輔助提取法中蛋白質(zhì)雜質(zhì)最多。

已有較多研究表明多糖活性與其糖醛酸含量之間有很大的關(guān)聯(lián)，因此采用咔銼-硫酸法對四種樣品中糖醛酸含量進(jìn)行了測定，糖醛酸含量從高到底順序?yàn)椋篜NPMAE＞PNPEAE＞PNPUAE＞PNPHWE，其中PNPMAE的糖醛酸含量明顯高于其他三種樣品（p＜0.05）。

表1結(jié)果表明不同提取方法會(huì)對多糖的基本組成產(chǎn)生影響，與傳統(tǒng)熱水浸提相比，三種輔助提取方法均能夠提高多糖得率和多糖純度，其中微波輔助提取方法的多糖得率最高，同時(shí)其樣品的多糖純度和糖醛酸含量也最高。這與很多文獻(xiàn)的報(bào)道相一致。Zhao等[22]用超聲輔助提取方法增加了刺五加多糖的得率和多糖純度。Wang等[23]考察了熱水回流、超聲輔助、酶輔助和微波輔助四種方法對茯苓多糖基本組成和抗氧化活性的影響，結(jié)果表明微波輔助方法提高高了茯苓多糖的得率，增加甘露糖和糖醛酸含量的同時(shí)還增強(qiáng)了抗氧化活性。

2.2 不同提取方法得到的多糖分子量

多糖的分子量對其單糖組成、空間結(jié)構(gòu)和生物活性都有較大的影響[24]，因此，考察不同提取方法對蓮子心多糖分子量的分布就尤為重要。如圖1所示，PNPHWE（a）、PNPUAE（b）、PNPEAE（c）和 PNPMAE（d）的HPGPC譜圖均有四個(gè)信號峰（峰4為溶劑峰），意味著蓮子心多糖分子量分布主要包括三個(gè)組分，根據(jù)其分子量分布設(shè)定為高分子量組分（200 ku~350 ku，標(biāo)記為峰1）、中分子量組分（50 ku~150 ku，標(biāo)記為峰2）、低分子量組分（5 ku~25 ku，標(biāo)記為峰3），根據(jù)各個(gè)峰的面積可以計(jì)算出各組分的占比。從圖1可以看出：HWE和EAE得到的蓮子心多糖主要組分均為低分子量組分，UAE和MAE主要組分為高分種子量組分和低分子量組分。三個(gè)組分峰面積占比從高到底的順序?yàn)椋焊叻肿恿拷M分：PNPMAE＞PNPUAE＞PNPHWE＞PNPEAE；中分子量組分：PNPEAE＞PNPHWE＞PNPUAE＞PNPMAE；低分子量組分：PNPEAE＞PNPHWE＞PNPUAE＞PNPMAE。與傳統(tǒng)方法對比，三種輔助提取方法對蓮子心多糖三種分子量組分的分布有較大的影響，EAE一定程度上減少了高分子量組分的占比，增加了中分子量和小分子量組分的占比，這可能是由于酶輔助提取過程中破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)增加多糖溶出的同時(shí)會(huì)對多糖本身的鏈結(jié)構(gòu)造成破壞，從而導(dǎo)致高分子量組分的降低以及中分子量和小分子量組分的增加。MAE和UAE均明顯增加了高分子量組分的占比，減少了小分子量組分的占比。這可能是因?yàn)槲⒉ㄝo助提取方法可以在短時(shí)間內(nèi)提高溫度，迅速破壞組織結(jié)構(gòu)，從而增加高分子量組分的溶出[25]。同樣地，由于超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，經(jīng)過短時(shí)間的超聲處理，加速了高分子量多糖的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而提高了蓮子心多糖中高分子量組分的占比。

圖1 蓮子心多糖的分子量分布：水提（a）、超聲（b）、酶解（c）、微波（d）Fig.1 Molecular weight (Mw) distribution of PNP obtained by different extraction methods, PNPHWE (a), PNPUAE (b), PNPEAE(c) and PNPMAE (d)

以上結(jié)果表明，不同提取方法不僅會(huì)影響蓮子心多糖的分子量大小，而且會(huì)對不同分子量組分的分布產(chǎn)生較大的影響。已有較多研究表明，多糖的分子量對其空間結(jié)構(gòu)、表面形貌以及熱力學(xué)性質(zhì)、流變學(xué)性質(zhì)等有較大影響，如Guo等[26]的研究表明，玉米絲三種不同分子量多糖的空間結(jié)構(gòu)和表面形貌存在較大差異。Wang等[27]用超聲波降解黃茶多糖后發(fā)現(xiàn)其空間結(jié)構(gòu)、表面形貌均發(fā)生較大變化。同時(shí)，Hu等[28]的研究表明酶解反應(yīng)對桑葉多糖的分子量帶來較大影響，最終帶來不同的熱力學(xué)性質(zhì)和流變學(xué)性質(zhì)。

2.3 單糖組成分析

多糖中單糖種類和含量的不同會(huì)對多糖糖鏈的連接方式及其空間結(jié)構(gòu)造成影響，并最終導(dǎo)致生物活性的不同。因此我們需要探究不同提取方法對蓮子心多糖的單糖組成的影響。結(jié)果如圖2所示，對照標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)出峰時(shí)間判斷不同方法得到的蓮子心多糖的單糖組成，表2列出了各個(gè)樣品單糖組成的摩爾百分比。根據(jù)四種多糖樣品的摩爾百分比結(jié)果可知，蓮子心多糖主要單糖組成包括葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。與傳統(tǒng)熱水浸提相比，超聲輔助法使得半乳糖含量增高，葡萄糖的含量減少，并且在PNPUAE樣品中沒有檢測到木糖的存在；微波輔助提取法在保持單糖組成類型不變的情況下，改變了摩爾百分比，增加了半乳糖糖醛酸的占比，和 2.1中糖醛酸含量的測定結(jié)果相符；經(jīng)過酶解處理后的蓮子心多糖半乳糖、葡萄糖和甘露糖的含量都有所增加，與超聲處理后相同，PNPEAE樣品中未見有木糖的出現(xiàn)。由此可見，不同處理方法對蓮子心多糖的單糖組成的種類和比例都有所影響。已有較多研究表明，多糖的單糖組成中糖醛酸的含量會(huì)對其生物活性有較大影響[29-33]，在不改變多糖單糖組成類型的情況下，微波輔助提取法增加了糖醛酸的占比，可作為一種用來增加蓮子心多糖的生物活性的輔助提取方法。

圖2 蓮子心多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 The FT-IR spectrum of PNP obtained by different methods

表2 不同樣品單糖組成的摩爾百分比含量Table 2 Mole percentage content of monosaccharide composition of different samples

2.4 紅外光譜對比分析

紅外光譜可以用來分析多糖的糖苷鍵類型、官能團(tuán)的類型以及糖環(huán)構(gòu)型等[34]，通過對比分析四種不同方法得到的蓮子心多糖的紅外光譜圖，可以判斷不同提取方法對蓮子心多糖特征結(jié)構(gòu)帶來的影響。如圖2所示，在4 000~500 cm-1的范圍內(nèi)，四種蓮子心多糖樣品均具有相似的多糖特征吸收峰，說明四種多糖有相似的特征結(jié)構(gòu)。在3 367.7 cm-1處是-OH伸縮振動(dòng)吸收峰[35]，2 931.8 cm-1處是C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰[36]，1 650.1 cm-1和1 549.8 cm-1是C=O的不對稱和對稱伸縮振動(dòng)吸收峰[37]，1 245.0 cm-1為C-O伸縮振動(dòng)的信號吸收峰，1 000~1 200 cm-1的信號峰表示蓮子心多糖中同時(shí)存在吡喃糖環(huán)和呋喃糖環(huán)。在834.3 cm-1處有吸收峰，表明蓮子心多糖存在α-糖苷鍵。和其他三種方法相比，微波提取得到的多糖樣品在1 753.2 cm-1處有較為微弱的信號峰，意味著有較多的糖醛酸含量[38]。以上結(jié)果表明，不同的提取方法不會(huì)影響蓮子心多糖的一級結(jié)構(gòu)和糖環(huán)的類型。

2.5 掃描電子顯微鏡分析

掃描電子顯微鏡（SEM）是一種用于高分辨率微區(qū)形貌分析的大型精密儀器?？捎脕碛^察蛋白、多糖等生物大分子的表面形貌。采用SEM對不同方法提取得到的蓮子心多糖表面形貌特征進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。PNPHWE呈現(xiàn)出大的塊狀結(jié)構(gòu)形貌并且表面粗糙。經(jīng)過UAE提取得到的蓮子心多糖PNPUAE形狀更為碎片化，部分呈現(xiàn)圓塊兒狀，且表面光滑，這說明超聲輔助提取在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)增加提取率的同時(shí)還會(huì)對多糖表面形貌帶來影響[39,40]。EAE提取得到的蓮子心多糖PNPEAE表面形貌和熱水浸提得到的蓮子心多糖較為相似，能夠最大限度的保持原來的表面形貌。MAE提取得到的蓮子心多糖PNPMAE仍然呈現(xiàn)片狀，但與其他三種方法提取得到的蓮子心多糖相比，PNPMAE最大的改變在于表面形貌呈現(xiàn)疏松多孔狀。這種疏松多空狀結(jié)構(gòu)可能是由于在微波提取過程中提取溫度快速升高所導(dǎo)致[41,42]，這種多孔狀結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致蓮子心多糖暴露出更多活性基團(tuán)，從而使得其具有較好的生物活性。

圖3 不同提取方法對應(yīng)蓮子心多糖的表面形態(tài)Fig.3 Surface Morphology of PNP prepared by different methods

2.6 圓二光譜分析

圓二色光譜是用于推斷非對稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的一種旋光光譜，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的分析。多糖的圓二色性與其糖苷鍵類型、空間結(jié)構(gòu)及基團(tuán)相互作用等有關(guān)[43]。因此，可以通過對比圓二光譜圖來評估不同提取方法對蓮子心多糖的影響。如圖4所示，在190~260 nm范圍內(nèi)，PNPHWE、PNPUAE、PNPEAE、PNPMAE的圓二色譜表現(xiàn)出相似的趨勢。PNPHWE在208和222 nm附近表現(xiàn)出負(fù)的科頓效應(yīng)，超聲輔助和微波輔助提取使得圓二色譜信號發(fā)生一定程度的藍(lán)移并且信號強(qiáng)度有所增強(qiáng)。而酶輔助提取法使得蓮子心多糖發(fā)生明顯紅移，并且在 208 nm附近的信號明顯減弱，222 nm附近的信號有所增強(qiáng)?？祁D效應(yīng)位置和強(qiáng)度的改變與樣品中不對稱結(jié)構(gòu)及其程度有關(guān)，這說明不同種提取方法對蓮子心多糖的空間結(jié)構(gòu)會(huì)有一定的影響[44,45]。

圖4 不同提取方法得到的蓮子心多糖的圓二色譜圖Fig.4 CD spectrum of PNP obtained by different methods

2.7 熱穩(wěn)定性分析

多糖的熱穩(wěn)定性會(huì)影響其在食品工業(yè)的應(yīng)用，利用TG、DTG和DSC對蓮子心多糖的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5和表3。如圖5所示，根據(jù)TG曲線，四種樣品的第一次的質(zhì)量變化主要是由于樣品中結(jié)合水的失去所導(dǎo)致的，由此可得出四種樣品結(jié)合水的含量分別為：PNPHWE14.37%，PNPUAE11.56%，PNPEAE12.38%，PNPMAE13.75%。而之后的失重變化是由于樣品多糖的解聚和裂解所導(dǎo)致，包括C-C、C-O鍵的斷裂等，從而生成CO、CO2和H2O，并最終形成多核芳香族和石墨碳結(jié)構(gòu)。根據(jù)DSC曲線：四種樣品均具有兩個(gè)吸熱峰，根據(jù)主要吸熱峰的ΔH值排序PNPMAE（54.89 J/g）＞PNPHWE（49.28 J/g）＞PNPUAE（39.35 J/g）＞PNPEAE（38.95 J/g），可見，微波輔助提取得到的蓮子心多糖有更高的熱穩(wěn)定性，與DTG得到的結(jié)果一致。

圖5 不同提取方法得到的蓮子心多糖的TG-DSC分析結(jié)果Fig.5 TG-DSC analysis of PNP prepared by different methods

表3 不同提取方法得到的蓮子心多糖的TG/DTG/DSC結(jié)果Table 3 TG/DTG/DSC results of PNP prepared by different methods

微波輔助提取方法得到的蓮子心多糖穩(wěn)定性最好，超聲和酶解處理會(huì)導(dǎo)致蓮子心多糖穩(wěn)定性有所下降?？偠灾兴姆N方法得到的蓮子心多糖都具有較好的熱穩(wěn)定性?？梢詽M足其在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的生產(chǎn)應(yīng)用。

2.8 流變性質(zhì)分析

分別測定了不同剪切速率和不同溫度對不同提取方法得到的蓮子心多糖表觀粘度的影響，如圖6所示，PNPHWE、PNPUAE、PNPEAE和 PNPMAE溶液均表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為。樣品溶液的表觀粘度隨剪切速率的增加而降低。另外，熱水浸提、超聲輔助提取和酶輔助提取表現(xiàn)出相似的表觀粘度，而微波輔助提取得到的蓮子心多糖相比其他三種方法有更高的表觀粘度，說明微波輔助提取會(huì)增加蓮子心多糖溶液的表觀粘度，但并不會(huì)改變其剪切稀化行為。這種表觀粘度的增加可能和 PNPMAE大分子量組分的含量較高有關(guān)，有很多研究表明較大分子量的多糖有更高的表觀粘度，如 Yang等[46]的研究發(fā)現(xiàn)超聲降低黑醋栗多糖分子量后，其表觀粘度也隨之降低。Nie等[47]從不同品種的黃秋葵中提取得到不同分子量的多糖，發(fā)現(xiàn)其表觀粘度隨著分子量的增加逐漸增強(qiáng)。

圖6 不同提取方法得到的蓮子心多糖的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)剪切曲線Fig.6 Steady shear flow curves of PNP obtained by different methods

動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的測定，蓮子心多糖溶液的動(dòng)態(tài)振蕩剪切測試結(jié)果可以通過振動(dòng)試驗(yàn)來確定，如圖7所示，在0.1~100 rad/s范圍內(nèi)，蓮子心多糖樣品的G'和G''隨掃描頻率的增加而不同程度地增加，表明，所有樣品均有掃描頻率依賴性，結(jié)合圖8蓮子心多糖樣品的tanδ值，能夠得知四種蓮子心多糖樣品均表現(xiàn)出液體和固體的特征[21]。在較低的頻率下，四種多糖樣品的G''模量高于G'模量，即tanδ＞1，多糖樣品表現(xiàn)出更強(qiáng)的液體粘性；在較高的頻率下，四種多糖樣品的G'模量高于G''模量，即tanδ＜1，多糖樣品表現(xiàn)出較強(qiáng)的固體彈性[48]。而當(dāng)頻率達(dá)到某個(gè)特定值時(shí)，兩條曲線相交，此時(shí)tanδ值為1，交點(diǎn)為交叉頻率，交叉頻率的值能夠反映多糖樣品的粘彈性[49]。PNPHWE、PNPUAE、PNPEAE和PNPMAE交叉頻率值分別為39.81、37.44、38.46和50.23 rad/s。其中PNPMAE的交叉頻率較高，說明其具有較好的成膠性能，這可能和微波提取得到的蓮子心多糖有更多大分子量組分有關(guān)[48,50]。

圖7 不同頻率掃描下蓮子心多糖的儲(chǔ)存模量和損耗模量Fig.7 Frequency sweeps performance for determining the storage modulus G＇ and loss modulus G″ for PNP prepared by different methods

圖8 蓮子心多糖的損耗角正切值Fig.8 The tanδ of PNP prepared by different methods

3 結(jié)論

本文探究了四種提取方法對蓮子心多糖基本性質(zhì)、分子量分布、單糖組成、紅外光譜、SEM、圓二色譜、熱力學(xué)性質(zhì)、流變學(xué)性質(zhì)的影響。三種輔助提取方法提高了蓮子心多糖的得率，分子量發(fā)生不同程度的降解。不同提取方法對蓮子心多糖單糖組成的種類和比例也有所影響，三種輔助提取方法增加了半乳糖的含量，而且微波輔助提取法與熱水浸提法單糖組成種類相同。通過熱力學(xué)和流變學(xué)分析，可知微波輔助提取方法得到的蓮子心多糖有高的熱穩(wěn)定性和更好的流變性能。綜上所述，微波輔助提取法具有更高的得率、多糖純度以及糖醛酸含量，多孔的表面結(jié)構(gòu)、更好的熱穩(wěn)定性以及流變學(xué)性能使得其具有更大的食品工業(yè)應(yīng)用潛力。微波輔助提取多糖工藝的優(yōu)化、分離純化及其結(jié)構(gòu)特征和生物活性需要進(jìn)一步探究。