不同產(chǎn)地甘草藥材質(zhì)量評價

陳玉娥，馮 沖，楊詩慧，劉奇越，劉尉棋，杜遠(yuǎn)遠(yuǎn)，馬恩耀*，周勁松

(1.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510006；2.廣東漢潮中藥科技有限公司，廣東廣州 510006)

甘草為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效，可用于治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽痰多、脘腹和四肢攣急疼痛、癰腫瘡毒等病癥，并緩解藥物毒性、烈性[1]。作為藥食同源的中藥材大品種，甘草具有兩千多年的藥用歷史。甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)輯注》[2]，“一名美草，一名密甘”，因其“調(diào)和眾藥有功”又名“國老”[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草主要含有三萜類、黃酮類、多糖類、香豆素類等活性成分，具有抗腫瘤[5]、抗菌[6]、調(diào)節(jié)免疫[7-8]、抗纖維化[9-10]、保護(hù)神經(jīng)[11]、保肝降糖[12-14]等藥理活性[15]。另外，四逆散傳統(tǒng)湯劑、復(fù)方顆粒劑、配方顆粒劑中均含有不同含量的甘草酸和甘草苷[16]。甘草主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古自治區(qū)、甘肅省、寧夏回族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)等地。作為大宗品種之一，甘草不僅可以作為藥用，其還可以應(yīng)用于食品、化妝品、煙草等領(lǐng)域。因此，甘草的需求量日益增加，野生甘草供不應(yīng)求，栽培甘草逐漸占領(lǐng)市場成為甘草的主要貨源。

在中藥產(chǎn)業(yè)源頭的種植基地，中藥材屬農(nóng)副產(chǎn)品，經(jīng)藥材市場或生產(chǎn)加工才被稱為中藥。對藥農(nóng)而言，種植的中藥是一種農(nóng)副產(chǎn)品，大多數(shù)僅看到眼前的經(jīng)濟(jì)效益，不會認(rèn)為這是用于治病救人的中藥而嚴(yán)格把控種植的各個環(huán)節(jié)，農(nóng)藥、化肥的過度使用，不合理的大規(guī)模種植栽培伴隨著連種障礙和土地污染，造成中藥材普遍存在質(zhì)量不達(dá)標(biāo)、農(nóng)藥殘留或重金屬超標(biāo)現(xiàn)象[17]。目前中藥材質(zhì)量評價常用的方法有逐步判別分析法、熵權(quán)TOPSIS法、R型聚類分析法等。逐步判別法是利用檢驗(yàn)方法對變量進(jìn)行逐步篩選，找出顯著性變量并剔除不顯著變量，同時進(jìn)行判別的一種方法；熵權(quán)TOPSIS法是依據(jù)分析對象與理想化目標(biāo)的接近程度進(jìn)行順序優(yōu)選的一種多指標(biāo)決策分析方法，可將多個指標(biāo)綜合成一個指標(biāo)進(jìn)行分析，降低了因指標(biāo)因素不足而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)欠準(zhǔn)確性，具有較高的科學(xué)性；R型聚類分析是對變量進(jìn)行分類處理的一種方法，可呈現(xiàn)個別變量之間、各個變量組合之間的關(guān)系的親疏程度。因此，該試驗(yàn)采集了不同產(chǎn)地甘草樣品，以2020年版《中國藥典》為依據(jù)，對甘草樣品進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、甘草苷和甘草酸含量的檢測，并通過逐步判別分析法、熵權(quán)TOPSIS法、R型聚類分析法研究不同產(chǎn)地的甘草，探索適用于不同產(chǎn)地甘草的統(tǒng)計分析方法，最終實(shí)現(xiàn)對不同產(chǎn)地的甘草進(jìn)行質(zhì)量評價。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。萬分之一天平(AP225WD，日本島津公司)；百萬分之一微量分析天平(XBR36，梅特勒-托利多精密儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(J-HH-6A，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司)；數(shù)顯鼓風(fēng)恒溫干燥箱(GZX-9070，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；箱式電阻爐(SX2-4-10Z，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；微波消解儀(Multiwave Pro，安東帕中國有限公司)；電感耦合等離子質(zhì)譜儀(7800，安捷倫科技有限公司)；高效液相色譜儀(UltiMate3000，賽默飛世爾科技有限公司)。

1.1.2試劑。鉛(CDJS-GSB04-1742-2004，50 mL)、鎘(CDJS-GSB04-1721-2004，50 mL)、砷(CDJS-GSB04-1714-2004，50 mL)、汞(CDJS-GSB04-1729-2004，50 mL)、銅(CDJS-GSB04-1725-2004，50 mL)，均出自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；甘草苷對照品(111610，中國食品藥品檢定研究院)；甘草酸銨對照品(110731，中國食品藥品檢定研究院)。

1.1.3試材。該試驗(yàn)收集了2個省份4個不同產(chǎn)區(qū)的甘草藥材及飲片，并根據(jù)產(chǎn)地對樣品進(jìn)行了分組和編號(表1)。

表1 甘草樣品信息Table 1 Sample information of Glycyrrhiza uralensis

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1高效液相色譜法測定甘草苷和甘草酸。

1.2.1.1色譜條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，利用流動相乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～8 min，19% A；8～35 min，19%～50% A；35～36 min，50%～100% A；36～40 min，100%～19% A)，其檢測波長為237 nm；進(jìn)樣量10 μL；理論板數(shù)按甘草苷峰計算應(yīng)不低于5 000。

1.2.1.2對照品溶液的制備。取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每l mL含甘草苷20 μg、甘草酸銨0.2 mg的溶液，其中，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.020 7。

1.2.1.3供試品溶液的制備。取甘草藥材粉末(過3號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2中藥材質(zhì)量評價方法。運(yùn)用軟件SPSS 23.0中的逐步判別分析法、熵權(quán)TOPSIS法、R型聚類分析法對4個產(chǎn)區(qū)甘草樣品的各項(xiàng)檢測指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分的檢測按2020年版《中國藥典》(四部)水分測定法(通則0832第二法)、灰分測定法(通則2302)項(xiàng)下總灰分及酸不溶性灰分測定法分別對水分、總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行測定。按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)甘草按干燥品計算，其水分不得超過12.0%，總灰分不得超過7.0%，酸不溶性灰分不得超過2.0%。從檢測結(jié)果(表2)可以看出，全部甘草樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中來自甘肅省白銀市景泰縣的3號樣品水分最低(6.7%)、2號樣品總灰分最低(3.0%)，而來自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市巴音烏素的7號和10號樣品酸不溶性灰分最低(0.03%)。

表2 常規(guī)檢測結(jié)果Table 2 Routine test results 單位：%

2.2 重金屬的檢測甘草的重金屬和有害元素依照《中國藥典》鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321電感耦合等離子體質(zhì)譜法)規(guī)定，鉛不得超過5 mg/kg，鎘不得超過1 mg/kg，砷不得超過2 mg/kg，汞不得超過0.2 mg/kg，銅不得超過20 mg/kg。從表3可以看出，全部甘草樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅這5種重金屬的殘留量均未超過《中國藥典》所規(guī)定的限度，且內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢的樣品重金屬含量最低。

表3 重金屬元素含量 Table 3 Content of heavy metal elements 單位：mg/kg

2.3 甘草苷和甘草酸含量的測定取約0.2 g甘草藥材粉末為材料，通過高效液相色譜法測定甘草苷和甘草酸。按《中國藥典》干燥品標(biāo)準(zhǔn)計算，含甘草苷(C21H22O9)不得少于0.5%，甘草酸(C42H62O16)不得少于2.0%。從表4可以看出，全部甘草樣品中甘草苷和甘草酸均符合國家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最低限，其中，甘肅省白銀市景泰縣2號樣品的甘草酸和甘草苷的含量最高，分別為5.5%和3.1%。

2.4 不同產(chǎn)地甘草的質(zhì)量鑒定

2.4.1逐步判別分析法。運(yùn)用SPSS 23.0對4個產(chǎn)區(qū)的甘草樣品的各項(xiàng)檢測指標(biāo)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(K個獨(dú)立樣本的檢測)，檢測不同產(chǎn)區(qū)的各檢測指標(biāo)是否有差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表5)，4個產(chǎn)區(qū)之間的水分、酸不溶灰分和汞均存在顯著差異(P<0.05)，其他檢測指標(biāo)的差異均不顯著(P>0.05)。

對測定結(jié)果進(jìn)行逐步判別分析，根據(jù)不同指標(biāo)，從中篩選出引起顯著性差異的樣品，剔除多余變量并建立產(chǎn)區(qū)判別模型，分析結(jié)果顯示有5個指標(biāo)被引入判別模型中，分別是酸不溶灰分、水分、銅、砷、汞。利用5個檢測指標(biāo)建立的判別模型，將產(chǎn)地不同的15份甘草樣品分為4組，分別為甘肅省白銀市景泰縣(G1)、甘肅省蘭州市榆中縣(G2)、內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市巴音烏素(G3)、內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢(G4)，其整體產(chǎn)區(qū)的回判正確率為100%(表6)。從圖1可以看出，4個產(chǎn)區(qū)的甘草可以通過這5種指標(biāo)明顯區(qū)分，說明這5個指標(biāo)對甘草產(chǎn)區(qū)有較好的判別效果。

表4 甘草苷和甘草酸的含量 Table 4 Contents of glycyrrhizin and glycyrrhizic acid 單位：%

表5 非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果Table 5 Statistical results of nonparametric test

表6 不同產(chǎn)區(qū)甘草的分類結(jié)果Table 6 Classification results of Glycyrrhiza uralensis in different production areas

圖1 典則判別函數(shù)Fig.1 Canonical discriminant function

2.4.2熵權(quán)TOPSIS法分析。運(yùn)用SPSSAU在線分析軟件，將表2中的水分、總灰分、酸不溶性灰分的數(shù)據(jù)進(jìn)行逆向化處理，表4中甘草酸、甘草苷的數(shù)據(jù)進(jìn)行正向化處理，處理后的具體結(jié)果見表7。熵權(quán)TOPSIS法分析中相對貼近度越接近于1，表明該產(chǎn)地的甘草質(zhì)量越優(yōu)。從表7可以看出，在甘肅省白銀市景泰縣的3批甘草中，評分排名分別為9、1、4，甘肅省蘭州市榆中縣的3批甘草中，評分排名分別為3、2、15，同一產(chǎn)區(qū)的藥材排名存在較大的差異；在內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市巴音烏素的4個批次樣品、內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢的5個批次樣品評分中，排名也存在較大差異。以上結(jié)果表明，熵權(quán)TOPSIS法分析效果較差，不適用于甘草的質(zhì)量評價過程。

表7 4個產(chǎn)區(qū)甘草TOPSIS評價計算結(jié)果Table 7 Calculation results of TOPSIS evaluation of Glycyrrhiza uralensis in four production areas

2.4.3R型聚類分析。聚類分析是指依據(jù)樣品數(shù)據(jù)的特征按照一定統(tǒng)計規(guī)則確定樣品的類別。采用SPSS 23.0軟件，將表2中的水分、總灰分、酸不溶性灰分的數(shù)據(jù)及表4中的甘草酸、甘草苷等數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將水分、總灰分、酸不溶性灰分、甘草酸、甘草苷作為分析變量，以Ward接法結(jié)合Squared Euclidean Distance距離計算方法對4個產(chǎn)區(qū)的15批甘草進(jìn)行R型聚類分析，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，同一產(chǎn)區(qū)批次的甘草聚類效果較為明顯，不同產(chǎn)區(qū)批次甘草之間具有較好的區(qū)分性，系統(tǒng)聚類分析法對于不同產(chǎn)區(qū)甘草的質(zhì)量評價效果明顯。其中，內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市巴音烏素4個批次的甘草樣品聚類分析中屬于同一分支，內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢5個批次甘草屬于同一支，但甘肅省白銀市景泰縣、甘肅省蘭州市榆中縣的甘草樣品聚類效果較差，可以判定不屬于同一支。因此，由聚類分析法可知，甘肅2個產(chǎn)區(qū)的樣品幾乎不屬于同一類，而內(nèi)蒙古2個產(chǎn)區(qū)樣品聚類效果較好，但無法將甘肅樣品區(qū)別于內(nèi)蒙古樣品，此法判別效果一般?？紤]到該試驗(yàn)所用不同產(chǎn)地甘草的樣本量偏少，可能影響聚類分析法的判別效果，若樣本量足夠充足時，該法可能具有更好的判別效果。

3 結(jié)論與討論

中藥材的質(zhì)量與中藥材的效價息息相關(guān)。我國是中藥材的生產(chǎn)大國，但由于種源混亂和生產(chǎn)管理不規(guī)范等原因使得中藥材的質(zhì)量參差不齊，甚至許多不符合質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)的中藥材流入市場。因而對于不同產(chǎn)地的中藥材質(zhì)量進(jìn)行鑒別有利于篩選優(yōu)良種源的中藥，并擴(kuò)繁優(yōu)良種源家系的中藥材，從而提升中藥材的質(zhì)量與效價。目前對中藥材的質(zhì)量評價體系的建立已經(jīng)逐步開展。中藥材質(zhì)量的評價依賴于多個項(xiàng)目判別與檢測，主要包括藥材的性狀特征、藥效成分、分子標(biāo)記。

該研究以4個產(chǎn)地(甘肅省白銀市景泰縣、甘肅省蘭州市榆中縣、內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市巴音烏素、內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢)的甘草為材料，根據(jù)2020年版《中國藥典》所記載的方法測定甘草樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、甘草酸和甘草苷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明從單因素分析4個產(chǎn)地的甘草均符合藥材質(zhì)量的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。通過利用多個指標(biāo)變量進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，4個不同產(chǎn)地的甘草樣品中水分、酸不溶灰分和汞存在顯著差異(P<0.05)。再用逐步判別分析說明5個指標(biāo)(酸不溶灰分、水分、銅、砷、汞)較其他檢測指標(biāo)更適于不同產(chǎn)地甘草的判別，將這5個檢測指標(biāo)引入判別模型，發(fā)現(xiàn)所建立的判別模型回判率達(dá)到100%，而這也表明5個指標(biāo)在不同產(chǎn)地間存在較大的差異。利用R型聚類分析發(fā)現(xiàn)甘肅2個產(chǎn)區(qū)的甘草樣品差距較大，不能歸為一類，而內(nèi)蒙古2個產(chǎn)區(qū)樣品聚類效果較好，但總體而言R型聚類分析無法將甘肅樣品區(qū)別于內(nèi)蒙古樣品，此法判別效果一般。此外，盡管嘗試運(yùn)用熵權(quán)TOPSIS法分析各產(chǎn)地甘草樣品的優(yōu)劣，得到結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘肅2號樣品更具有優(yōu)勢，但是由于同一產(chǎn)地重復(fù)組樣品差距較大，因此不具有統(tǒng)計意義。

綜上所述，該研究對不同產(chǎn)地甘草藥材的指標(biāo)進(jìn)行檢測并運(yùn)用不同統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，初步判斷4種產(chǎn)地的甘草藥材符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外，盡管逐步判別分析能使用5個指標(biāo)(酸不溶灰分、水分、銅、砷、汞)判別不同產(chǎn)地的甘草，但事實(shí)上對不同指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析仍較為困難，無法準(zhǔn)確判斷不同產(chǎn)地甘草的優(yōu)劣。分析原因可能是該試驗(yàn)所檢測指標(biāo)易受氣候環(huán)境、種植模式、采收加工等因素的影響，因此為了準(zhǔn)確判別不同產(chǎn)地甘草的優(yōu)劣勢，計劃利用大量樣品和檢測指標(biāo)，并進(jìn)一步運(yùn)用更多不同的統(tǒng)計方法篩選剔除不合理數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

圖2 4個產(chǎn)區(qū)甘草藥材的R型聚類分析Fig.2 R-type cluster analysis of Glycyrrhiza uralensis in 4 production areas