6%羥乙基淀粉130/0.4對創(chuàng)傷性家兔炎癥介質(zhì)及其信號通路的影響*

呂洪錦，張 倩，黃紹艷，張建中△

(1.龍口市人民醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺 265700；2.濱州醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院，山東 煙臺 264000；3.煙臺市煙臺山醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺 264000)

創(chuàng)傷后機體存在不同程度的炎性反應，引起白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細胞因子釋放[1]。創(chuàng)傷性炎癥介質(zhì)能使毛細血管通透性增加、大量蛋白質(zhì)滲出造成水腫，也能使血管內(nèi)中性粒細胞變形和黏附能力增強，使其更易游走至間質(zhì)并釋放炎癥介質(zhì)，在組織中形成“瀑布式”的炎癥級聯(lián)反應而加重機體損傷[2]。微小RNA(miRNA)在機體炎性反應和免疫應答中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。miR-146a是首先被證實在免疫系統(tǒng)中具有負向調(diào)控免疫炎性反應的miRNA[4]，被認為是固有免疫及適應性免疫細胞分化的重要調(diào)控者。miR-146a主要通過其靶基因IL-1受體相關(guān)激酶 1(IRAK1)和TNF受體相關(guān)因子 6(TRAF6)在協(xié)調(diào)免疫和炎癥信號傳導中發(fā)揮作用[5]?；罨?IRAK1、TRAF6可引起Toll樣受體-4(TLR4)及核因子-κB(NF-κB)過度表達，促進炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6的釋放，miR-146a的抗炎作用在一定程度上通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮作用[6]。

羥乙基淀粉(HES)130/0.4是第3代HES，可降低 IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子而減少創(chuàng)傷患者的炎性反應[7]；注射HES可降低急性肺損傷大鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB表達水平[8]，從而減輕炎性反應，具有抗炎作用，但其作用機制尚不明確。因而建立創(chuàng)傷家兔模型，模擬創(chuàng)傷患者損傷及手術(shù)治療過程，探討HES對創(chuàng)傷性家兔炎癥介質(zhì)及miR-146a/TLR4/NF-κB的影響，明確HES減輕創(chuàng)傷性炎性反應作用機制具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 2022年4月選取新西蘭雄性家兔(購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，貨號37009214625)16只作為研究對象，采用隨機數(shù)字表法分為乳酸鈉林格(LR)組和HES組，每組8只。本研究獲醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 將家兔麻醉后用鈍器敲打家兔后肢造成后肢骨折，然后行骨折切開內(nèi)固定術(shù)。麻醉方法：5%異戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射，異戊巴比妥鈉2～5 mg/(kg·h)靜脈維持。常規(guī)備皮、聚維酮碘消毒，鋪無菌巾。骨折部位外側(cè)切口，顯露股骨骨折部位，術(shù)中將骨膜縱行切開，以保留骨膜完整性，胯骨折線置入合適的國產(chǎn)四孔鋼板，遠近端各2枚螺釘固定，在骨折對應肌肉組織2 cm×2 cm作為軟組織缺損模型，同時，取血液和少量肌肉組織備檢(T0)?？p合肌肉和皮膚，飼養(yǎng)在清潔環(huán)境中。LR組注射10 mL/kg LR，HES組注射10 mL/kg HES，每天1次，輸注5 d，完成后麻醉取2組家兔血液和損傷部位肌肉備檢(T1)。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血液TNF-α、IL-1、IL-6水平 T0、T1時經(jīng)耳緣靜脈采集2組家兔血液，離心后吸取上清液，-70 ℃冰箱保存待檢。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書進行操作；酶標儀吸收450 nm波長檢測A值。各孔得到的A值減去空白組A值為各孔實際A值，用于反映血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法測定肌肉組織NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平 將損傷肌肉組織研磨后放入蛋白裂解液進行裂解，2 h后取混合液離心后收集上清液加入蛋白上樣緩沖液，根據(jù)二辛可酸法蛋白定量結(jié)果上樣，通過凝膠電泳凝膠分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，加入針對NF-κB P65(貨號ab76302，英國Abcam公司)、TLR4(貨號ab13556，英國Abcam公司)、IRAK1(貨號ab18256，英國Abcam公司)、TRAF6(貨號ab76302，英國Abcam公司)的一抗4 ℃孵育過夜，采用Western洗滌緩沖液洗后加入二抗，采用微型化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，應用ImageJ軟件分析條帶密度，計算蛋白表達量。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(PCR)法檢測肌肉組織miR-146a水平 將2組家兔T0、T1時肌肉組織研磨成細粉后加入環(huán)氧樹脂管中，加入裂解/結(jié)合緩沖液、無水乙醇、氯仿等攪拌混勻，將混合液分次加入一個吸附柱RNase-free吸附套管中，經(jīng)多次離心取出吸附柱RNase-free吸附套管，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將純化的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量-PCR擴增，最終按熒光定量-PCR試劑盒說明書在熒光定量-PCR儀器中操作，以U6作為內(nèi)參。引物序列：miR-146a，正向：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反向：5′-GGGTGAGA ACTGAATTCCA-3′。U6，正向：5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAAAT-3′，反向：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′ 。

2 結(jié) 果

2.12組家兔不同時間點炎性細胞因子水平比較 與T0時比較，2組家兔T1時血液TNF-α、IL-1、IL-6水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LR組比較，HES組家兔T1時血液TNF-α、IL-1、IL-6均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組家兔不同時間點炎性細胞因子水平比較

2.22組家兔不同時間點NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較 與T0時比較，2組家兔T1時TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LR組比較，HES組家兔T1時TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 2組家兔不同時間點NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

圖1 2組家兔不同時間點NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

2.32組家兔不同時間點肌肉組織miR-146a表達水平比較 miR-146a在T0時數(shù)值為標準值1，與T0時比較，創(chuàng)傷后miR-146a在T1時相對數(shù)值：HES組為1.69±0.07，LR組為1.52±0.07；2組家兔在創(chuàng)傷后miR-146a表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HES組家兔T1時miR-146a表達水平明顯高于LR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

續(xù)表2 2組家兔不同時間點NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

圖2 2組家兔不同時間點肌肉組織miR-146a表達水平比較

3 討 論

HES 130/0.4是第3代HES，相對分子質(zhì)量為130×103，相對分子質(zhì)量降低且更加集中，對凝血及肝、腎功能的影響更小[7]。HES的使用爭論焦點主要在于腎功能損害，有研究表明，中等劑量HES[(10.3±4.7)mL/kg]在合適人群中使用不會增加腎損傷的風險，現(xiàn)在國內(nèi)將其廣泛用于創(chuàng)傷或臨床有失血癥狀的手術(shù)患者[9]。創(chuàng)傷刺激能引起機體免疫系統(tǒng)細胞釋放大量炎癥介質(zhì)，炎性反應的輕重取決于促炎性細胞因子水平，其中主要促炎性細胞因子有IL-1、IL-6、TNF-α等[2]。促炎性細胞因子可激發(fā)NF-κB的表達，而NF-κB反過來可提高IL-6、TNF-α水平，形成一個表達的正反饋。有研究發(fā)現(xiàn)，HES可通過影響TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子的促炎及抗炎反應平衡而誘導大鼠淋巴細胞的增殖與分化，HES還可抑制巨噬細胞蛋白增加[10]，并且早期應用HES更加有利于抑制炎性反應[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HES可通過抑制NF-κB途徑降低炎性反應，從而降低毛細血管滲漏[12]。創(chuàng)傷和手術(shù)刺激主要通過啟動炎性反應及促進釋放大量細胞因子，進而引發(fā)全身應激反應。本研究使用創(chuàng)傷家兔模擬創(chuàng)傷患者損傷及手術(shù)治療過程，因損傷部位的炎性反應最明顯，所以，取損傷部位肌肉作為不同治療組進行對照研究，結(jié)果顯示，與LR組比較，HES組家兔T1時TNF-α、IL-1、IL-6水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明使用HES可降低創(chuàng)傷性炎性細胞因子水平。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其在免疫功能的調(diào)節(jié)、免疫細胞生長與分化和自身免疫的預防中均具有重要作用，主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達，最終影響信號通路下游蛋白分子的表達而發(fā)揮作用，且絕大多數(shù) miRNA 對基因表達的作用是抑制性的，具有負反饋作用[3，13]。miR-146a是在免疫系統(tǒng)中具有重要調(diào)節(jié)作用的miRNA，尤其是在免疫應答及炎性反應方面的調(diào)節(jié)作用[4]。IRAK1在各種細胞中廣泛表達，主要作用是作為一種受體蛋白激酶參與了TLR等信號傳導通路，對炎性反應具有重要的調(diào)節(jié)作用。TRAF6是一種重要的細胞內(nèi)多功能信號分子，具有獨特的受體結(jié)合特異性。IRAK1、TRAF6作為miR-146a公認的靶基因，是全身炎癥及免疫應答的有效調(diào)節(jié)因子，miR-146a通常通過其發(fā)揮作用[5，14]。TLR4是一種膜結(jié)合蛋白，激活的TLR4可募集下游細胞內(nèi)髓樣分化因子88(MyD88)蛋白，MyD88通過miR-146a的IRAK1、TRAF6形成 MyD88-IRAKs-TRAF6 復合體參與信號傳導，最終作用于下游 NF-κB 通路，調(diào)節(jié)炎癥因子釋放[15]。TAGANOV等[16]發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激細胞可使NF-κB依賴的miR-146a表達水平升高，并已通過熒光素酶報告基因試驗和突變試驗證實。有研究在人工模擬炎癥疾病模型中使用miR-146a骨髓細胞定向遞送的方法，驗證了miR-146a通過靶向NF-κB信號通路抑制炎性反應[17]。當miR-146a表達水平升高時，IRAK1、TRAF6表達水平均下調(diào)，因此，認為miR-146a調(diào)控TLR/NF-κB信號通路應答炎性反應是以負反饋方式發(fā)揮作用的[18-19]。本研究結(jié)果顯示，2組家兔TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平在創(chuàng)傷后均明顯升高，HES組家兔T1時TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯低于LR組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明HES能抑制TLR4/NF-κB表達，從而減輕創(chuàng)傷性炎性反應。本研究同時發(fā)現(xiàn)，2組家兔創(chuàng)傷后miR-146a表達水平均明顯升高，而HES組家兔創(chuàng)傷后miR-146a表達水平更高。表明HES可能通過上調(diào)miR-146a表達抑制IRAK1、TRAF6的產(chǎn)生，使TLR4/NF-κB活化減少而抑制炎性反應。

綜上所述，HES可減輕創(chuàng)傷性家兔的炎性反應，其機制可能是HES通過調(diào)控miR-146a負反饋調(diào)節(jié)TLR4 信號通路的 IRAK1、TRAF6，降低NF-κB蛋白的表達，進而減少信號通路下游促炎性細胞因子IL-6、IL-1、TNF-α的表達。然而，本研究未添加通路抑制劑進行反向驗證，今后將進一步完善分組設(shè)置進行研究。