赤芍治療銀屑病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

沈樹青，賈 敏，胡文韜，狄 偉

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，局限或廣泛分布[1-2]，治療困難，常終身患病。銀屑病分為尋常型、紅皮病型、膿皰型和關(guān)節(jié)病型，以尋常型最為常見[3]，約占病例的90%以上[4]，治療以生物制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、維A酸類為主，不良反應(yīng)較多。

銀屑病中醫(yī)稱為“白疕”[5]，辨證論治規(guī)律為“辨血為主、從血論治”[6]，基本證型分為血熱證、血燥證和血瘀證，治療以清熱涼血解毒、養(yǎng)血潤燥為主[3]。赤芍來自毛茛科植物，根部入藥，具有清熱涼血、散瘀止痛等功效，藥理活性包括保肝、抗炎、抗腫瘤、保護心血管和神經(jīng)等[7]。與西醫(yī)藥治療比較，恰當?shù)厥褂弥嗅t(yī)藥具有增效減毒的優(yōu)勢。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從“中藥-成分-靶點-疾病”的思路對赤芍的有效成分、潛在靶點、生物學(xué)功能、蛋白互作、信號通路進行了可視化展示，初步分析了赤芍治療銀屑病的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 將TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的赤芍有效成分和作用靶點，以及通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得的銀屑病相關(guān)基因作為研究對象，取交集后得到赤芍和銀屑病的核心基因。

1.2方法

1.2.1中藥有效活性成分及作用靶點篩選 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“赤芍”，設(shè)置篩選標準口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18得到赤芍的有效成分及作用靶點，繼而利用Perl軟件(V5.36.0)和UniProt知識庫(https：//www.uniprot.org/)篩選出靶點。

1.2.2疾病靶點預(yù)測 在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)中搜索關(guān)鍵詞“psoriasis”，獲得相關(guān)靶點。

1.2.3中藥-疾病共同靶點篩選 利用Vinny(2.1.0)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將赤芍成分靶點和銀屑病相關(guān)靶點通過線韋恩圖進行一一映射，獲得赤芍和銀屑病的共同靶點交集圖。

1.2.4中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用Perl軟件進行處理赤芍-銀屑病靶點，利用Cytoscape(3.9.1)軟件構(gòu)建赤芍-成分-靶點-銀屑病繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5中藥-疾病靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 將赤芍成分靶點和銀屑病相關(guān)的靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org/cgi/)構(gòu)建PPI圖，篩選種屬選擇“Homo sapiens”，設(shè)置最小互作分數(shù)值為0.4，并通過R語言計算各節(jié)點的度值得到柱形圖進行可視化分析。

1.2.6基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用Bioconductor平臺(http：//bioconductor.org/biocLite.R)和R語言ggplot2包對獲得的基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將結(jié)果導(dǎo)入微生信在線作圖平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1赤芍的有效成分及靶點 赤芍的有效活性成分共119個，初篩得到29個，有效成分對應(yīng)的靶點41個。見表1。

表1 赤芍的有效活性成分

續(xù)表1 赤芍的有效活性成分

2.2疾病靶點篩選及赤芍-銀屑病共同靶點預(yù)測 獲取與銀屑病相關(guān)靶點1 287個，赤芍與銀屑病共同靶點21個，包括ESR1、PGR、RELA、VEGFA、NFKBIA、GSTP1、IGF2、GSTM1、GSTM2、白細胞介素-6(IL-6)、PTGS1、BCL2、FOS、CASP3、TP63、HIF1A、FOSL1、CCNB1、AHR、PON1和PLAU，均為赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 赤芍有效成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.3中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 赤芍主要依靠11種活性成分通過21個靶點治療銀屑病，如β-谷甾醇、芍藥苷、谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、黃芩素、菠菜甾醇、(2R，3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、豆甾-7-烯醇、兒茶素(+)、菜油甾醇等。

2.4PPI 赤芍治療銀屑病的潛在靶點PPI圖由21個節(jié)點和172條邊組成。見圖2。中藥-疾病核心靶點前10位按鄰接節(jié)點數(shù)目由多至少依次為ESR1、HIF1A、IL-6、PGR、VEGFA、FOS、RELA、CASP3、NFKBIA和AHR等。ESR1的鄰接節(jié)點均為30個靶蛋白基因，HIF1A、IL-6的鄰接節(jié)點均為28個靶蛋白基因，PGR、VEGFA的鄰接節(jié)點均為26個靶蛋白基因，F(xiàn)OS、RELA的鄰接節(jié)點均為24個靶蛋白基因，是該網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點，表明其可能是赤芍治療銀屑病的關(guān)鍵基因。見圖3。

圖2 中藥-疾病靶點PPI圖

圖3 核心靶點排序

2.5GO功能富集分析 286個生物學(xué)過程主要涉及抗氧化反應(yīng)、對無機物的應(yīng)答、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；5個細胞組成涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、分泌顆粒管腔等；35個分子功能涉及轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。見圖4。

2.6KEGG通路富集分析 包括77條通路，共同靶點主要富集于癌癥通路、化學(xué)致癌-受體激活、化學(xué)致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、輔助性T淋巴細胞17(Th17)細胞分化、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路等。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，赤芍含有的β-谷甾醇、菠菜甾醇、黃芩素、鞣花酸、豆甾醇等活性成分可能為治療銀屑病的關(guān)鍵。5種成分均具有抗炎功效，鞣花酸通過降低脂多糖引起的血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β水平[8]，可抑制被認為是銀屑病致病主要驅(qū)動力的TNF-α[9]，從而抑制炎癥的發(fā)生。黃芩素通過降低TNF-α水平而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。王昭等[10]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩素干預(yù)后膿毒癥大鼠血清升高的TNF-α、IL-6水平均有所下降，降低的T淋巴細胞亞族百分比、Th1/Th2值均有所升高，表明黃芩素可下調(diào)膿毒癥大鼠炎性細胞因子水平、改善免疫功能。有研究表明，β-谷甾醇可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的激活而抑制CAS1的產(chǎn)生及絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化，導(dǎo)致細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成顯著減少，從而起到抗炎作用[11]。菠菜甾醇是一種安全的抗炎藥，其抗炎機制包括抑制環(huán)氧合酶、拮抗瞬時受體電位通道香草酸亞型-1受體和減弱促炎性細胞因子和介質(zhì)[12]。ANTWI等[13]發(fā)現(xiàn)，豆甾醇除能減輕免疫球蛋白E介導(dǎo)動物的皮膚過敏反應(yīng)、減小反應(yīng)面積外，還能減少動物抓撓行為，顯著減少皮膚組織的表皮層增厚和炎癥細胞浸潤，表明豆甾醇在治療皮膚過敏性疾病方面具有一定潛力。

本研究通過構(gòu)建的PPI圖及條形圖顯示，排列前5的靶蛋白包括ESR1、HIF1A、IL-6、PGR和VEGFA。ESR1是雌激素受體α的編碼基因，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控對雌激素信號通路下游效應(yīng)的調(diào)控至關(guān)重要[14]。OLFM作為一種瞬時上調(diào)的炎癥信號，ESR1是OLFM4誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞信號傳導(dǎo)的中樞，通過調(diào)節(jié)皮膚的真皮和表皮細胞而促進傷口愈合[15]。TANG等[16]研究表明，尋常型銀屑病的病灶中HIF1A高表達。CD4+T淋巴細胞的過度激活和Th17/Th1分化是銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵，促炎性細胞因子IL-23誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞中CDK7表達增加并激活蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白/ HIF1A信號通路，增強糖酵解代謝。相應(yīng)地，CDK7抑制通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白/ HIF1A途徑顯著損害了IL-23誘導(dǎo)的糖酵解，從而激活T淋巴細胞和Th17/Th1分化，促進銀屑病的發(fā)病[17]。IL-6是Th1的重要組成成分，是一種多效性細胞因子，具有促炎和抗炎雙重作用，參與了調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、血細胞生成、上皮細胞及免疫細胞增殖和分化等。當IL-6表達失常時，其參與炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。有研究證明，IL-6是銀屑病細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，參與了銀屑病的發(fā)病，并且與浸潤的細胞成分和皮膚基底角質(zhì)形成細胞的增殖有關(guān)[18]。BENHADOU等[19]研究表明，角質(zhì)形成細胞、免疫細胞和內(nèi)皮細胞上VEGFA介導(dǎo)的銀屑病表型大多數(shù)是角質(zhì)形成細胞中VEGFA信號以FLT1/NRP1依賴的方式傳遞的結(jié)果。

赤芍治療銀屑病的GO功能富集分析主要涉及抗氧化反應(yīng)、對無機物的應(yīng)答、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物學(xué)過程；涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、分泌顆粒管腔等細胞組成；涉及轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。氧化應(yīng)激是銀屑病病理生理學(xué)的另一個重要因素，在銀屑病中氧化還原失衡已經(jīng)在皮膚細胞和系統(tǒng)中，以及在血漿和血細胞中[20]，從而加重皮損的發(fā)生。

赤芍治療銀屑病的KEGG通路富集分析效應(yīng)機制主要與癌癥通路、化學(xué)致癌-受體激活、化學(xué)致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Th1細胞分化、IL-17信號通路、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等有關(guān)。在多條癌癥通路中提示，銀屑病與腫瘤存在著細胞過度增殖的相似性，且抑制細胞的能量供應(yīng)亦能有效減輕銀屑病皮膚增殖和炎性反應(yīng)[21]。IL-17被認為是重要的免疫介質(zhì)，不僅介導(dǎo)皮損的發(fā)展，而且介導(dǎo)銀屑病相關(guān)共病的發(fā)生[20]。在與心血管疾病相關(guān)的流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路方面的證據(jù)表明，IL-17可能是心血管疾病和銀屑病炎癥之間的聯(lián)系之一[22]。

本研究結(jié)果顯示，赤芍有效成分包括鞣花酸、黃芩素、β-谷甾醇、菠菜甾醇和豆甾醇等，協(xié)同作用于與疾病相關(guān)的ESR1、HIF1A、IL-6、PGR、VEGFA等靶蛋白，調(diào)節(jié)癌癥通路、化學(xué)致癌-受體激活、化學(xué)致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Th1細胞分化、IL-17信號通路、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路等來緩解抗氧化反應(yīng)、對無機物的應(yīng)答、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，調(diào)節(jié)激活因子結(jié)合及轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子等方式而發(fā)揮其治療作用，充分發(fā)揮了中藥多成分、多靶點、多通路治療疾病的特點，初步分析了赤芍主要通過抗氧化反應(yīng)和調(diào)控細胞炎性反應(yīng)來發(fā)揮治療銀屑病的作用，為后續(xù)研究提供了理論參考依據(jù)。