MicroRNA-155/Nrf2對體外培養(yǎng)雪旺細胞增殖和遷移的影響及作用機制*

趙飛，姚忠軍，曹洪，朱必濤，張彌

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 骨2科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 皮膚科，湖北 十堰 442000）

坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷是臨床上較常見的周圍神經(jīng)損傷，易致組織破壞和痛覺過敏[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特有的膠質(zhì)細胞，在周圍神經(jīng)損傷后促進神經(jīng)自發(fā)再生[3-5]。神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進神經(jīng)再生，但該因子在臨床應(yīng)用上受到限制[6]。因此，迫切需要尋找新的方法保護雪旺細胞并提高其增殖、遷移等功能，促進神經(jīng)再生，對治療坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷等周圍神經(jīng)損傷具有重要意義。miRNA 是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，在周圍神經(jīng)損傷后表達失調(diào)，并影響雪旺細胞表型[7-8]。有研究顯示，miR-155 在坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷大鼠中高表達，抑制其表達可緩解神經(jīng)損傷引起的痛感和炎癥反應(yīng)[9-10]。然而，miR-155 在雪旺細胞中的功能與機制尚不明確。生物信息學(xué)在線工具starBase 預(yù)測發(fā)現(xiàn)核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）可能是miR-155 的下游靶標，Nrf2 與細胞的增殖、遷移密切相關(guān)。神經(jīng)生長因子（Ngf）、層粘連蛋白（Laminin）是介導(dǎo)細胞增殖和遷移的關(guān)鍵成分，但miR-155 是否靶向Nrf2 調(diào)控Ngf 和Laminin 表達，介導(dǎo)雪旺細胞增殖、遷移仍不清楚。故本研究以體外培養(yǎng)的雪旺細胞作為研究對象，進一步探討miR-155 對雪旺細胞增殖、遷移的調(diào)控作用與潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和材料

大鼠雪旺細胞（RSC96，中國科學(xué)院細胞庫），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司），RNA 提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試 劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物工程技術(shù)研究有限公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），miR-155 mimics、miR-155 inhibitor、小干擾RNA Nrf2 [si-Nrf2、si-Nrf2（1）、si-Nrf2（2）]（蘇州吉諾瑞生物科技有限公司），Lipofectamine 3000 細胞轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司），蛋白酶抑制劑混合液、RIPA 細胞裂解液（湖南艾佳生物科技股份有限公司），ECL 發(fā)光試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），兔抗Nrf2 抗體（1∶1000，武漢博士德生物工程有限公司），TransZolTMUP 試劑（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），PVDF 膜（美國Millipore 公司），pmirGLO 載體（上海生工生物工程股份有限公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 將大鼠雪旺細胞RSC96置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在條件為37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液1 次。細胞達到80%融合，傳代培養(yǎng)。為驗證miR-155 過表達/抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果，探究miR-155 對雪旺細胞增殖、遷移的影響，將細胞分為inhibitor NC組（細胞轉(zhuǎn)染inhibitor NC 質(zhì)粒）、miR-155 inhibitor 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 質(zhì)粒）、miR-NC 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-NC 質(zhì)粒）、miR-155 mimics 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 質(zhì)粒）。為了驗證Nrf2 沉默效果，將細胞分為si-NC 組（細胞轉(zhuǎn)染si-NC 質(zhì)粒）、si-Nrf2（1）組[細胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2（1）質(zhì)粒]、si-Nrf2（2）組[細胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2（2）質(zhì)粒]。為證實靶向Nrf2 可實現(xiàn)miR-155 對細胞增殖、遷移的影響和Nrf2、Ngf、Laminin mRNA 相對表達量的調(diào)控作用，擬抑制miR-155 表達的同時選取Nrf2 沉默效果較好的質(zhì)粒（si-Nrf2）轉(zhuǎn)染細胞行挽救實驗，探討miR-155 的作用是否會部分逆轉(zhuǎn)，將細胞分為miR-155 inhibitor+si-NC組（細胞轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 和si-NC 質(zhì)粒）、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組（細胞轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor和si-Nrf2 質(zhì)粒）。探究miR-155 對細胞增殖、遷移的作用以及miR-155 靶向Nrf2，要想證實miR-155 是通過調(diào)控Nrf2 發(fā)揮其作用，需要做挽救實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的雪旺細胞，按照2.5×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h。細胞達到60%～80%融合后，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書要求，取2 μL Lipofectamine 3000 加入198 μL無血清培養(yǎng)基，混勻，靜置5 min 獲得Lipofectamine 3000 稀釋液。將miR-155 mimics（50 nmoL）、miR-155 inhibitor（50 nmoL）、si-Nrf2（1）（100 nmoL）和si-Nrf2（2）（100 nmoL）及陰性對照質(zhì)粒（miR-NC、inhibitor NC、si-NC）分別加入200 μL 無血清培養(yǎng)基中，混勻，獲得質(zhì)粒稀釋液。然后，將上述兩種稀釋液混合，靜置15 min 后取100 μL 加入到含1 mL 無血清培養(yǎng)基的細胞中，混勻，于培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 用于后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞，以3 000 個/孔的密度接種至96 孔板中，inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-NC 組、miR-155 mimics 組均轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h；inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-155 inhib‐itor+si-NC 組、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組轉(zhuǎn)染相 應(yīng)質(zhì)粒，均培養(yǎng)48 h。然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，測定450 nm 波長吸光度值。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移 Transwell 小室下室加入600 μL 含10%血清的培養(yǎng)基，取相應(yīng)處理組細胞懸液150 μL 加入Transwell 小室中，3×104個細胞/孔，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后取出Transwell 小室，棄掉每孔中的培養(yǎng)液、用無鈣的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）清洗2 遍，4%多聚甲醛固定30 min。用0.1%結(jié)晶紫染色20 min 后，使用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞。使用PBS 洗滌3 遍，于顯微鏡（×100）下拍照，并用Image J 軟件分析。

1.2.5 qRT-PCR 測定mRNA 表達 將按分組處理好的雪旺細胞（1×105個/孔）接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h。細胞轉(zhuǎn)染處理后加入預(yù)冷的PBS 潤洗2 次，吸棄PBS，每孔加入1 mL 的TransZolTMUP 試劑提取總RNA，并以RNA 作為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，反應(yīng)體系：RNA 1 μL，Oligo（dT）1 μL，Reaction Mix 10 μL，Enzyme Mix 1 μL，RNase-free Water 7 μL，42℃孵育15 min，85℃加熱5 s。然后，以此cDNA 為模板參照引物序列進行qRT-PCR 擴增，擴增體系：Green qPCR Supermix 10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，cDNA 模板1 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL；反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，將U6作為miR-155 內(nèi)參，GAPDH作為其他基因內(nèi)參。基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting測定蛋白表達 將按分組處理好的雪旺細胞（3×106個/mL）接種于6 孔板中并培養(yǎng)過夜。細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，加入RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑），提取雪旺細胞總蛋白，測定每組蛋白樣品濃度。取5 μL 蛋白預(yù)染Marker 和30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，剪下Marker 目的條帶和內(nèi)參條帶所在區(qū)域的膜。將膜放入相應(yīng)的一抗稀釋液中4℃孵育過夜，洗膜后再結(jié)合二抗1 h。最后，使用ECL 化學(xué)發(fā)光液于多功能凝膠成像系統(tǒng)進行曝光成像，其中Actin 作為內(nèi)參。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗測量熒光素酶活性 分別將Nrf2 的3'-UTR 全長和Nrf2 突變體克隆到pmirGLO 載體中，獲得野生型Nrf2 和突變型Nrf2 報告載體。將細胞以1 × 105個/孔的密度接種于24孔板中，并通過lipofectamine 3000 將報告載體和miR-155 mimics、miR-155 inhibitor 或陰性對照miRNC、inhibitor NC 共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細胞，通過熒光素酶報告實驗測定熒光素酶活性以評估m(xù)iR-155 與Nrf2 的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8 和SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用Tukey post hoc test 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-155相對表達量比較

inhibitor NC 組miR-155 相對表達量為（1.00±0.08）、miR-155 inhibitor 組為（0.29±0.04）、miR-NC組 為（1.00±0.14）、miR-155 mimics 組 為（2.63±0.18），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=188.200，P=0.000）。miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組降低，miR-155 mimics 組較miR-NC 組升高，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.2 各組不同時間點吸光度值比較

inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-NC組、miR-155 mimics 組0 h、24 h、48 h、72 h 的吸光度值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示：①不同時間點間的細胞增殖有差異（F=554.000，P=0.000）；②各組細胞增殖有差異（F=147.500，P=0.000）；③細胞增殖的變化趨勢有差異（F=32.100，P=0.000）。見表2 和圖1。

表2 各組不同時間點吸光度值比較（）

表2 各組不同時間點吸光度值比較（）

圖1 各組不同時間點吸光度值的變化趨勢（）

2.3 各組細胞遷移數(shù)比較

miR-NC 組細胞遷移數(shù)為（278±9）個/視野、miR-155 mimics 組為（523±5）個/視野、inhibitor NC組為（274±21）個/視野、miR-155 inhibitor 組為（153±14）個/視野，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=394.300，P=0.000），miR-155 inhibitor 組 較inhibitor NC 組減少，miR-155 mimics 組較miR-NC 組增加。表明miR-155 抑制雪旺細胞遷移。見圖2。

圖2 miR-155抑制雪旺細胞遷移（×100）

2.4 各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較

各組Ngf、Laminin mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組 高，miR-155 mimics 組 較miR-NC 組低。表明miR-155 抑制Ngf、Laminin mRNA 相對表達。見表3。

表3 各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較（）

表3 各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較（）

2.5 各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較

各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），miR-155 inhibitor 組 較inhibitor NC 組升高，miR-155 mimics 組較miR-NC 組降低。見表4、圖3。

圖3 各組Nrf2蛋白水平比較

表4 各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較（）

表4 各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較（）

2.6 Nrf2與miR-155的關(guān)系

在線生物信息學(xué)工具starBase 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-155 與Nrf2 存在潛在結(jié)合位點，并構(gòu)建了突變序列（見圖4）。各組野生型Nrf2 細胞熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），miR-155 inhibitor組較inhibitor NC 組升高，miR-155 mimics 組較miRNC 組降低。各組突變型Nrf2 細胞的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，miR-155 與Nrf2 存在靶向關(guān)系。見表5。

表5 各組熒光素酶相對活性比較（）

表5 各組熒光素酶相對活性比較（）

圖4 miR-155與Nrf2的結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果

2.7 沉默效果驗證實驗中各組Nrf2 mRNA相對表達量比較

沉默效果驗證實驗中si-NC 組Nrf2 mRNA 相對表達量為（1.00±0.07）、si-Nrf2（1）組為（0.46±0.07）、si-Nrf2（2）組為（0.34±0.09），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.140，P=0.000），si-Nrf2（1）組和si-Nrf2（2）組較si-NC 組降低，且si-Nrf2（2）組效果更好。

2.8 挽救實驗中各組Nrf2 mRNA相對表達量比較

挽救實驗中各組Nrf2 mRNA 相對表達量為（1.00±0.14）、miR-155 inhibitor 組為（1.97±0.12）、miR-155 inhibitor+si-NC 組為（1.89±0.10）、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為（1.23±0.08），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.410，P=0.000），miR-155 inhibitor 組 較 inhibitor NC 組 高，miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉(zhuǎn)miR-155 inhibitor 對Nrf2 表達的調(diào)控。

2.9 挽救實驗中各組細胞吸光度值比較

挽救實驗中inhibitor NC 組細胞吸光度值為（0.40±0.05）、miR-155 inhibitor 組為（0.80±0.06）、miR-155 inhibitor+si-NC 組為（0.85±0.06）、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為（0.52±0.06），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=44.370，P=0.000），miR-155 inhibitor 組 較 inhibitor NC 組 高，miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉(zhuǎn)miR-155 inhibitor 對雪旺細胞增殖的調(diào)控。

2.10 挽救實驗中各組細胞遷移數(shù)量比較

挽救實驗中inhibitor NC 組細胞遷移數(shù)量為（262±19）個/視野、miR-155 inhibitor 組為（493±28）個/視野、miR-155 inhibitor+si-NC 組為（487±23）個/視野、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為（304±37）個/視野，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=57.160，P=0.000），miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC組增加，miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組減少。表明si-Nrf2 可部分逆轉(zhuǎn)miR-155 inhibitor 對雪旺細胞遷移的調(diào)控。

2.11 挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較

挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA 相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組高，miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉(zhuǎn)miR-155 inhibitor對Ngf、Laminin mRNA 相對表達量的調(diào)控。見表6。

表6 挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較（）

表6 挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較（）

3 討論

近年來，miRNAs 的研究引起了人們的關(guān)注，旨在為神經(jīng)再生提供更深入的機制研究和可靠的生物靶點。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生過程中調(diào)節(jié)各種復(fù)雜的細胞行為和生物活性[11-12]。有證據(jù)顯示，抑制miR-155 可以減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變的坐骨神經(jīng)損傷，突顯了作為神經(jīng)損傷治療靶點的潛力[13]。這也提示，miR-155可能參與了周圍神經(jīng)再生和修復(fù)的過程。

雪旺細胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)中獨特的膠質(zhì)細胞，其主要參與建立周圍神經(jīng)再生的有利微環(huán)境。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細胞發(fā)生如去分化、增殖、遷移和髓鞘形成等一系列表型的改變[14-16]。在這些表型中，增殖和遷移能力對雪旺細胞的自發(fā)再生和神經(jīng)損傷部位的修復(fù)具有重要意義[17]。雪旺細胞在周圍神經(jīng)損傷后期能沿受損軸突遷移，促進軸突長距離再生[18]。因此，增加雪旺細胞數(shù)量和提升雪旺細胞遷移能力是損傷治療的主要任務(wù)。近年來的研究表明，MiR-3099 促進雪旺細胞增殖和遷移[19]；miR-148b 通過調(diào)控其靶基因的表達影響雪旺細胞的增殖與遷移能力[20]。盡管已有研究初探了miR-155 在神經(jīng)損傷中的作用，但miR-155 是否是雪旺細胞增殖和遷移的關(guān)鍵分子尚不清楚。本研究首次證實了miR-155 對雪旺細胞增殖和遷移調(diào)控作用，抑制miR-155 的表達可促進雪旺細胞增殖、遷移。

Ngf 是神經(jīng)細胞生長、維持和存活的重要蛋白質(zhì)，也是神經(jīng)元存活途徑中的關(guān)鍵信號分子[21]。層黏連蛋白Laminin 是基底層的重要組成部分，支持細胞的分化、遷移、黏附、表型和存活。實驗發(fā)現(xiàn)，雪旺細胞轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后Ngf 和Laminin 表達水平顯著升高，而轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 的細胞Ngf 和Laminin 表達水平顯著降低。這些證據(jù)表明，miR-155 調(diào)控雪旺細胞增殖可能是通過影響Ngf 和Laminin 表達介導(dǎo)的。

已有文獻報道，在損傷的周圍神經(jīng)中Nrf2 通路失活，且過表達Nrf2 能夠促進周圍神經(jīng)損傷后雪旺細胞介導(dǎo)的功能修復(fù)[22-23]。也有文獻報道，Nrf2 參與調(diào)控細胞的增殖和遷移[24]。在本研究中，miR-155過表達明顯抑制Nrf2 的表達，而抑制miR-155 顯著促進Nrf2 的表達，且沉默Nrf2 能部分逆轉(zhuǎn)miR-155 inhibitor 對雪旺細胞增殖和遷移的調(diào)控作用。這些結(jié)果提示，miR-155 靶向調(diào)控Nrf2 通路的活化，影響雪旺細胞功能。

綜上所述，抑制miR-155 可能通過激活Nrf2 通路，上調(diào)Ngf、Laminin 的表達，促進雪旺細胞的增殖和遷移。本研究將有助于加深對非編碼RNA 在周圍神經(jīng)修復(fù)和再生中的生物學(xué)功能的理解，并為坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷等臨床診斷和治療策略提供科學(xué)依據(jù)。