Akk菌在消化道疾病中的研究進(jìn)展*

趙佳琳，董衛(wèi)國

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,湖北 武漢 430060）

近些年來，腸道菌群在宿主疾病轉(zhuǎn)歸過程中扮演了何種角色一直是醫(yī)學(xué)界的研究焦點(diǎn)，且相關(guān)的益生菌產(chǎn)品被投入臨床使用后獲得了較多的正面反饋，因此，陸續(xù)有科學(xué)家提出下一代益生菌（nextgeneration probiotics,NPGs）的概念。相較于第一代益生菌（主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌），NPGs 符合美國食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)活生物治療產(chǎn)品的定義：①含有活生物體，如細(xì)菌；②適用于人類疾病或病癥的預(yù)防、治療或治愈；③不是疫苗[1]。Akk 菌作為NGPs 中的明星菌株，因其減輕體重和改善糖脂代謝的作用而受到廣泛關(guān)注[2]，與此同時(shí)，Akk 的活體菌株、巴氏消毒株（PAm）、外膜蛋白Amuc_1100、胞外囊泡（AmEV）等主要衍生物被應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)中，以探尋該菌的不同活性和組分在各個(gè)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制。眾多因果性研究證明Akk 菌參與了2 型糖尿病、阿爾茲海默病、衰老等病理、生理過程[3]。而本文專注于闡述Akk 菌在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）、結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）、肝病等消化系統(tǒng)疾病中的最新研究進(jìn)展，并討論該菌在臨床上作為生物制劑在腸道和肝臟疾病的應(yīng)用前景。

1 Akk菌及其主要衍生物的生化特征

2004 年有研究者從1 例健康成年志愿者的糞便中分離出了一種在黏蛋白降解細(xì)菌里占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的MucT 菌株，并將其命名為Akk 菌，該菌是一種革蘭陰性、厭氧的細(xì)菌，在37℃和pH 值為6 的環(huán)境中能達(dá)到最快生長(zhǎng)速率[4]。其在患者嬰兒時(shí)期就定植于腸道黏液層并進(jìn)行大量繁殖，且豐度在1 年內(nèi)就能發(fā)展到接近成年人的水平，占腸道微生物群的1%～3%，而在老年人中有所下降[5]。

黏液層中豐富的黏蛋白是Akk 菌賴以存活的碳源和氮源，其由富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的肽核組成，而該肽核則通過糖苷鍵連接的寡糖修飾，并由唾液酸或硫酸基終止[4]。在適宜的生長(zhǎng)條件下，Akk菌能上調(diào)多種糖苷水解酶的基因表達(dá)水平，其中以氨基糖、核苷酸糖、半乳糖水解酶最具代表性。此外，與能量代謝息息相關(guān)的腺苷三磷酸調(diào)節(jié)蛋白也在該菌的生長(zhǎng)和分裂增殖過程中起到了至關(guān)重要的作用[6]。

值得注意的是，人類腸道中的Akk 菌存在亞種水平的遺傳分層，換句話說，不同的菌株之間具有明顯的基因型和表型差異。通過這些差異可將Akk菌大致分為4 個(gè)系統(tǒng)群，其在耐氧性、上皮細(xì)胞黏附力、細(xì)菌聚集度、短鏈脂肪酸產(chǎn)出率等方面各有不同的優(yōu)勢(shì)，而這些表型會(huì)極大地影響細(xì)菌在腸道的定植以及對(duì)宿主的功能調(diào)節(jié)[7]。

將Akk 菌在70℃下加熱30 min 得到的PAm 較活菌有更強(qiáng)的改善糖脂代謝的能力，而這歸功于其外膜中的熱穩(wěn)定蛋白Amuc_1100，其能通過與腸上皮細(xì)胞表面的Toll 樣受體2（toll-like receptors 2,TLR2）結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)活性[8]。Amuc_1100 由Ⅳ型纖毛基因簇編碼，并通過N 端跨膜結(jié)構(gòu)域固定在菌株的外膜上，參與構(gòu)成了Akk 菌的纖毛。其在體外擁有可變的低聚體形態(tài)，且二聚體對(duì)TLR2 有最高的親和力，但其在體內(nèi)的組裝形式有待進(jìn)一步研究[9]。

脫離Akk 菌體的AmEV 作為黏膜遞送載體，在掃描電子顯微鏡下呈直徑為40～50 nm 的球形，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)腸道以外組織的功能調(diào)控[10]。

2 Akk菌在IBD中的保護(hù)性作用及機(jī)制

在克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）患者的腸上皮中，Akk 菌的豐度較健康人相比減少[11]。而與靜態(tài)UC 患者相比，活動(dòng)性UC 患者體內(nèi)的Akk 菌定植率更低，證實(shí)了該菌的含量與結(jié)腸活動(dòng)性炎癥呈負(fù)相關(guān)[12]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，用Akk 菌灌胃IBD小鼠數(shù)周后，小鼠的體重下降、結(jié)腸縮短等表現(xiàn)以及較高的組織病理學(xué)評(píng)分能夠得到逆轉(zhuǎn)，受損的腸道屏障和失調(diào)的菌群也得到部分恢復(fù)，且血清和組織中的抗炎細(xì)胞因子水平將會(huì)上升，而促炎細(xì)胞因子水平則會(huì)下降[13]，相關(guān)研究證明口服AmEV 也能夠發(fā)揮同樣的保護(hù)性作用[14]。

深層次的機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)揭示了Akk 菌降低腸道通透性和抑制結(jié)腸炎癥的多種調(diào)控途徑。首先是緊密連接蛋白的表達(dá)，Akk 菌外膜中的Amuc_1100與IECs 表面的TLR2 結(jié)合后會(huì)激活下游的AMPK 通路，最終增加胞膜中發(fā)揮骨架連接作用的Zo-1 蛋白，并同時(shí)抑制孔隙生成蛋白Claudin2的基因表達(dá)，這種雙重調(diào)控作用極大地維護(hù)了腸道屏障的完整度[15]。其次是IECs 的壽命與數(shù)量，Akk 活菌能夠下調(diào)鈣信號(hào)通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)，以此來緩解鈣離子濃度升高誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡。而失活的Akk菌可以改變炎癥IECs 的細(xì)胞周期，延長(zhǎng)生存時(shí)間[16]。更重要的是，Akk 菌在代謝過程中生產(chǎn)的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸，作用于IECs 上的G 蛋白偶聯(lián)受體后能加速腸道干細(xì)胞增殖以及向分泌譜系細(xì)胞分化，這種作用機(jī)制不僅能加速腸上皮的更新，還能增加黏液層的厚度[17]。

除此之外，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)也會(huì)受到此菌的影響。Akk 菌識(shí)別并激活腸細(xì)胞的TLR2 后會(huì)抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化，眾所周知，NF-κB 信號(hào)通路的激活將導(dǎo)致異常的炎癥反應(yīng)，而Akk 菌對(duì)此途徑的調(diào)控能降低腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1 等致炎因子的表達(dá)，并且轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 以及白細(xì)胞介素10 等抗炎物質(zhì)的濃度也會(huì)有所增加[15]。上述抑制炎癥的過程離不開腸道細(xì)胞表面TLR2 的識(shí)別與激活，但Akk 活菌、PAm 和Amuc_1100還能夠通過參與色氨酸（Tryptophan,Trp）的代謝來減輕結(jié)腸炎癥，并且不依賴結(jié)腸組織。UC 患者的腸道有過度的Trp 代謝激活，而Akk 菌能在腸細(xì)胞參與Trp 代謝的基因表達(dá)水平不變的情況下，抑制主要的犬尿氨酸途徑，恢復(fù)芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor,AhR）的多種配體水平，且AhR靶基因如白細(xì)胞介素10 的表達(dá)也會(huì)上調(diào)，這表明Akk 菌可通過調(diào)節(jié)Trp 的代謝從而激活A(yù)hR 信號(hào)通路，達(dá)到減輕結(jié)腸炎癥的效果[18]。

3 Akk菌在CRC中的保護(hù)性作用及機(jī)制

對(duì)CRC 患者的腸道黏膜組織樣本進(jìn)行微生物種類及含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Akk 菌的豐度與比例較健康人群高出許多[19]，且接受奧沙利鉑、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣聯(lián)合化療后的患者會(huì)有明顯的腸道菌落組成改變，其中Akk 菌的大量增殖與藥物的抗癌效果呈正相關(guān)[20]。免疫療法是當(dāng)代醫(yī)學(xué)在抗腫瘤領(lǐng)域的突破性成果，Akk 菌聯(lián)合白細(xì)胞介素2 對(duì)腸癌細(xì)胞的抑制效果較單獨(dú)使用白細(xì)胞介素2 顯著增強(qiáng)[21]。由此可見，Akk 菌有潛力成為檢出CRC 的細(xì)菌生物標(biāo)志，并有可能成為增加抗癌藥物療效的臨床策略。

從機(jī)制上來說，Akk 菌對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力和直接的殺細(xì)胞作用均有助于腫瘤細(xì)胞凋亡。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，Akk 菌結(jié)合其表面的TLR2 后能夠誘導(dǎo)NF-κB 激活，并加速炎癥小體NLRP3 的生成，而此物質(zhì)是把控巨噬細(xì)胞向抗腫瘤的M1 表型極化的關(guān)鍵因素[22]。另外，腸道中的CD8 細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的數(shù)量也可受到Akk 菌的調(diào)控，尤其是在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的免疫應(yīng)答階段?？诜Am 或Amuc_1100 能夠減少小鼠結(jié)腸腫瘤的數(shù)量與面積，延緩疾病的進(jìn)展，這種臨床緩解依賴于Akk 菌對(duì)腫瘤周圍及腸系膜淋巴結(jié)中的CTL 的募集，且被激活CTL 將會(huì)表達(dá)較高濃度的腫瘤壞死因子α 來抑制腫瘤，但幾乎不表達(dá)介導(dǎo)免疫逃逸的程序性死亡受體1[23]。值得一提的是，向患前列腺癌的小鼠靜脈注射AmEV 也能夠提高腫瘤組織中CD8 T 淋巴細(xì)胞和M1樣巨噬細(xì)胞的濃度，并能使淋巴細(xì)胞表達(dá)顆粒酶B和干擾素γ，從而起到抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，且有效劑量的AmEV 不會(huì)對(duì)健康組織產(chǎn)生毒害，還可使正常細(xì)胞耐受[24]。AmEV 對(duì)CRC 細(xì)胞是否具有殺傷力，以及向CRC 小鼠模型注射AmEV 的安全性或許能成為研究Akk 菌的新方向之一。

除了調(diào)控免疫細(xì)胞，Akk 菌還能通過分泌一種名為Amuc_1434 的天冬氨酸蛋白酶來實(shí)現(xiàn)黏液性CRC細(xì)胞的自噬與凋亡。Amuc_1434 不僅能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，利用氧化應(yīng)激引導(dǎo)胞內(nèi)線粒體功能障礙，還能上調(diào)死亡受體及腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體，通過內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路這兩條關(guān)鍵途徑激活腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。更有意義的是，黏液性CRC 組織的侵襲與擴(kuò)散也會(huì)受到Amuc_1434 的抑制，而黏蛋白2 是該酶的主要作用對(duì)象。黏蛋白在此類型CRC 中高度表達(dá)，與腫瘤增殖、擴(kuò)散及免疫逃逸密切相關(guān)。因此，Amuc_1434 對(duì)Muc2 的降解有助于延緩癌癥的進(jìn)展[26]。

4 Akk菌在肝病中的保護(hù)性作用及機(jī)制

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）因其在全球范圍內(nèi)的高患病率已成為慢性肝病的主要負(fù)擔(dān)，其特征在于機(jī)體代謝紊亂促發(fā)并推動(dòng)了肝細(xì)胞脂肪樣變性及功能障礙，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng)與纖維化，并最終導(dǎo)致肝硬化和/或惡變[27]，而Akk菌被證實(shí)與這一進(jìn)行性病程密切相關(guān)。

在NAFLD 的早期，腸道Akk 菌的高豐度代表了人體更為健康的代謝狀態(tài)，突出表現(xiàn)在空腹血糖、血漿甘油三酯、體脂分布這3 個(gè)指標(biāo)上[28]；而在NAFLD的中晚期，可觀察到糞便和結(jié)腸中Akk 菌種的耗竭，且這種現(xiàn)象特異性地與非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）的氧化損傷標(biāo)志物和纖維化指數(shù)呈正相關(guān)[29]。通過上述結(jié)論可以推斷，Akk 菌有極大的潛力成為預(yù)測(cè)NAFLD 患病風(fēng)險(xiǎn)的特定微生物指標(biāo)，以及疾病進(jìn)展期的無創(chuàng)診斷和預(yù)后工具。因?yàn)槟壳吧袩o有效的治療方法，因此NASH 的早期診斷有助于預(yù)防不良結(jié)局，而相較于創(chuàng)傷性和偏倚較大的肝活檢穿刺術(shù)，無創(chuàng)的新型生物標(biāo)志物如Akk 菌則能夠提供更安全、更準(zhǔn)確的替代方案。

不僅如此，在補(bǔ)充Akk 活菌、PAm 或AmEV 后，NASH 相關(guān)的血清炎性介質(zhì)、脂質(zhì)譜、轉(zhuǎn)氨酶等參數(shù)得以逆轉(zhuǎn)至正常水平，肝實(shí)質(zhì)的損害程度和肝臟炎癥細(xì)胞浸潤狀態(tài)也可得到有效改善，且分泌胞外基質(zhì)參與纖維瘢痕形成的活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSC）能夠消退至靜止?fàn)顟B(tài)[30]。此外，在其他類型的肝損傷，如酒精性和藥物性肝炎模型中，同樣能得到Akk 菌豐度與肝功能障礙之間呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論，且在恢復(fù)該菌的腸道定植率后，可觀察到肝臟壞死灶范圍和炎癥水平的降低[31-32]。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，Akk 菌有潛能成為挽救肝細(xì)胞損害、抑制肝臟間質(zhì)膠原生成、改善肝功能的益生菌制劑。

腸肝軸是腸道微生物與肝臟進(jìn)行雙向信號(hào)交流的重要途徑，也是Akk 菌干預(yù)肝炎的主要手段。當(dāng)腸道屏障遭受各種因素侵襲時(shí)，Akk 菌能增加緊密連接蛋白和黏蛋白的基因表達(dá)，并重塑失調(diào)的微生物群，以此來加固腸肝軸的第一道防線，避免細(xì)菌和內(nèi)毒素通過門靜脈易位至肝臟后被TLR4 識(shí)別并觸發(fā)炎癥[32]。除此之外，Akk 菌還能激活腸道中的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來保持門靜脈內(nèi)該氨基酸的水平，而高濃度的L-天冬氨酸可有效促進(jìn)腸肝軸上的脂質(zhì)氧化及膽汁酸代謝，并抑制活性氧的生成，從而達(dá)到減少肝臟脂肪沉積和肝細(xì)胞氧化凋亡的效果[33]。至關(guān)重要的是，當(dāng)導(dǎo)致肝損傷的病理因素持續(xù)存在時(shí)，長(zhǎng)期的病原體和炎癥刺激會(huì)讓原本靜止的HSC 分化為肌成纖維細(xì)胞，并分泌纖維蛋白將再生肝細(xì)胞分隔，成為違背肝臟原生結(jié)構(gòu)的假小葉雛形。而相較于Akk 活菌與PAm，AmEV 能顯著抑制活化HSC 的TLR5 和TLR9 的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)上調(diào)抗炎因子ppar-α 和ppar-β 的基因表達(dá)，最終使HSC 恢復(fù)至靜止?fàn)顟B(tài)，避免接下來的肝臟纖維化，且這種作用具有劑量依賴性[34]。由此可推測(cè)，Akk 菌能夠通過囊泡的分泌，由腸肝軸介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)肝臟早期纖維化的逆轉(zhuǎn)，即使目前尚未知其對(duì)已形成的纖維瘢痕有何功效，但抑制HSC 激活的重要功能足以使Akk 菌成為預(yù)防肝硬化的備選益生菌。

Akk 菌全身性的調(diào)節(jié)代謝作用對(duì)于預(yù)防非酒精性脂肪肝、延緩進(jìn)展為NASH 較局部的腸肝軸更有意義。Akk 菌的細(xì)胞裂解物通過增加絲氨酸蛋白酶抑制劑A3 同系物SERPINA3G 的濃度，可抑制下游ppar-γ、脂聯(lián)素等參與脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積累的基因表達(dá)，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝，最終達(dá)到減少脂肪組織內(nèi)脂肪細(xì)胞大小以及胞內(nèi)甘油三酯沉積的目的[35]。除了已知的Amuc 系列，新發(fā)現(xiàn)的P9 也是Akk菌分泌的一種蛋白，與胞間黏附分子2 結(jié)合后，可誘導(dǎo)體內(nèi)胰高血糖素樣肽-1 的分泌以及棕色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)，這種作用機(jī)制能夠有效促進(jìn)胰島素的水平和脂肪組織分解產(chǎn)熱，從而產(chǎn)生維持血糖平穩(wěn)和調(diào)節(jié)脂肪含量的促代謝效果[36]。

5 總結(jié)

Akk 菌及其衍生物通過改善宿主腸道屏障功能、調(diào)控免疫系統(tǒng)應(yīng)答、參與腸肝軸信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)新陳代謝水平等作用機(jī)制，在緩解結(jié)腸炎癥、抑制結(jié)直腸腫瘤、減輕肝臟損傷等方面展現(xiàn)出卓越的能力，且歐洲食品安全局就PAm 作為新型食品發(fā)表的意見中明確指出，當(dāng)食物中的活細(xì)胞數(shù)量<10 CFU/g時(shí)，目標(biāo)群體攝入PAm≤3.4×1010個(gè)/d 是安全的[37]。雖然一些研究結(jié)果表明，目前人類對(duì)Akk 菌在疾病中的具體作用和機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚存在一定的局限性，其作為益生菌制劑應(yīng)用于疾病的臨床診療還需要更多的實(shí)驗(yàn)去探究驗(yàn)證，但其診斷、預(yù)防和治療上述消化道疾病的潛能使之成為NPGs 中的佼佼者。