阿魏酸鈉經(jīng)RhoA和Rho-kinase信號(hào)通路抑制小鼠肝纖維化的機(jī)制研究*

趙蔚林 李 君

湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南省湘潭市 411102

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是肝臟受到損傷后，產(chǎn)生的一種持續(xù)存在狀態(tài)。其是肝臟組織開(kāi)始修復(fù)時(shí)，如果細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的合成與降解平衡狀態(tài)發(fā)生失衡，從而導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)的一系列病理學(xué)改變[1-2]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生肝纖維化時(shí)，如不及早進(jìn)行干預(yù)治療，將發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌?，F(xiàn)階段肝硬化、肝癌是我們國(guó)家常見(jiàn)病、多發(fā)病及重要的死亡原因，其病理主要特征為肝組織呈現(xiàn)彌漫性纖維化、假小葉及再生結(jié)節(jié)形成[3]。

據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的典型特征為肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)活化和ECM沉積[4]，分子機(jī)制涉及到炎癥因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子和氧化應(yīng)激相關(guān)分子等，因此，深入研究肝臟纖維化的發(fā)病機(jī)制，并由此基礎(chǔ)上探索新的治療靶點(diǎn)，在減少肝硬化和肝癌的發(fā)生尤為重要。

阿魏酸鈉(化學(xué)名稱(chēng)：3-甲氧基-4-羥基桂皮酸鈉鹽二水合物)系阿魏、川芎、當(dāng)歸等中藥提取物中的單體活性成分經(jīng)化學(xué)修飾所得?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗氧化、抗凝、抗炎、改善血液流變學(xué)等功效，現(xiàn)臨床上廣泛運(yùn)用于心血管系統(tǒng)疾病的治療[5]。但據(jù)最新研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉具有抑制肝纖維化的功效，但具體作用機(jī)制現(xiàn)階段尚不明確[6]。本研究將以信號(hào)通道為切入點(diǎn)，構(gòu)建以CCl4-花生油誘導(dǎo)肝纖維化模型，通過(guò)阿魏酸鈉治療的肝纖維化小鼠為研究對(duì)象，探討阿魏酸鈉抑制肝纖維化的分子作用機(jī)制，從而為臨床治療肝纖維化提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：雄性CL小鼠60只，體質(zhì)量160～210g(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：SYXK(湘)2015-0014。飼養(yǎng)條件：溫度25℃，濕度(55±10)%，給予標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。(2)主要試劑及儀器：阿魏酸鈉(成都嘉葉生物科技有限公司，純度：98%)。CCl4購(gòu)于江蘇清泉化學(xué)股份有限公司(批號(hào)20210901)；花生油購(gòu)于青島吳昊植物油有限公司。透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)和Ⅳ型膠原(CⅣ)試劑盒，BCA蛋白濃度測(cè)定、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑試劑盒均購(gòu)自上海透景生命科技股份有限公司；兔多克隆RhoA抗體、小鼠單克隆α-SMA 抗體購(gòu)于湖南純清生物科技有限公司。兔多克隆eNOS 抗體、ROCK抗體購(gòu)自廣東椰泰生物科技有限公司。DAB試劑盒購(gòu)于山東濱州智源生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠肝纖維化模型建立：適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對(duì)照組、模型組、給藥組，每組20只。模型組和對(duì)照組小鼠均灌胃給予 CCl4-花生油(1∶1，V/V)1ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)8周。從第9周開(kāi)始，給藥組各小鼠給予阿魏酸鈉20mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.2.2 小鼠肝臟標(biāo)本制作：12周后，將小鼠分別稱(chēng)重，并按照50mg/kg劑量戊巴比妥鈉，分別進(jìn)行麻醉，于腹主動(dòng)脈處取血，并分離，留取血清；同時(shí)制作各組肝臟組織標(biāo)本，逐個(gè)稱(chēng)肝重并記錄，然后用剪刀在各小鼠的肝臟相同部位剪取組織標(biāo)本，置于福爾馬林溶液中固定，剩余肝組織迅速置于-80℃冰箱中冰凍并留存[7]。

1.2.3 肝組織影像學(xué)檢測(cè)：對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠最后一次給予阿魏酸鈉灌胃后，當(dāng)即隨機(jī)從各組中抽取5只小鼠，分別對(duì)其進(jìn)行肝臟超聲檢測(cè)。對(duì)被檢測(cè)小鼠，予以禁食、不禁水8h，并按照體重，腹腔內(nèi)分別注射戊巴比妥鈉(給藥劑量：50mg/kg)，以麻醉小鼠，完善小鼠肝區(qū)體毛剃除，充分暴露肝臟體表投影區(qū)域，將其仰臥位固定于試驗(yàn)平板，采用飛利浦Affiniti 70彩色多普勒超聲診斷儀，并采用其配備彈性成像定量軟件包及eL18-4鉑凈線(xiàn)陣探頭(頻率：4～18MHz)。掃描小鼠肝臟，檢測(cè)肝臟大小、形態(tài)、軟硬度等指標(biāo)，得到二維均值。

1.2.4 肝功能及肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)：采集各組試驗(yàn)小鼠血清，運(yùn)用全自動(dòng)生化儀，對(duì)血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase， AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransfease，ALT)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)[8]。運(yùn)用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)儀，分別對(duì)小鼠血清標(biāo)本中肝纖維化指標(biāo)：透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)和層黏蛋白(LN)的含量進(jìn)行檢測(cè)，并分別記錄[3]。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)：分別對(duì)各試驗(yàn)組小鼠的肝臟組織，采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定48h以上，并常規(guī)使用石蠟包埋，制作成5μm厚度的組織切片，對(duì)其分別予以HE和Masson三色染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各試驗(yàn)組小鼠肝臟組織的病理染色情況[3]。并嚴(yán)格按照2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)一起聯(lián)合制定的《病毒性肝炎防治方案》中，對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)破壞類(lèi)型、范圍及程度，將對(duì)肝微循環(huán)影響的大小將肝纖維化劃分為1～4期(S1～4)[9]，見(jiàn)表1 。對(duì)各小鼠肝組織切片，在顯微鏡下拍照，并按照分組及病理變化分類(lèi)。

表1 肝纖維化分期

1.2.6 肝組織免疫組化檢測(cè)：將各組小鼠肝組織切片置放玻片上，使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ中10min浸泡，使其充分脫蠟；各組織乙醇浸泡6min，然后流水15min浸洗，再將載玻片置于PBS玻片缸，搖床上晃動(dòng)并洗滌6min×3次；在室溫、嚴(yán)格避光的環(huán)境下，予3% H2O2以20min孵育，再PBS洗滌6min×3次；滴加入5%BSA溶液，并采用室溫條件下封閉30min，傾除多余溶液。

1.2.6.1 肝臟組織中RhoA呈現(xiàn)情況：對(duì)兔來(lái)源抗RhoA，使用PBS對(duì)其1∶300比例進(jìn)行充分稀釋?zhuān)?0～100μl至切片，在10℃冰箱中孵育12h；取出后室溫下靜置2h，PBS反復(fù)洗滌10min×4次，再切片放至蘇木素染液中，染色15s后，使用流水浸洗10min，用普通顯微鏡觀察細(xì)胞核著藍(lán)色，予以二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別再浸泡處理20min；制作好的切片置于通風(fēng)櫥中，充分通風(fēng)20min，使其晾干，滴加中性樹(shù)膠，并采用玻片覆蓋，再次晾干；使用電子顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)改變，逐個(gè)攝片及保存。

1.2.6.2 肝臟組織中Rho-kinase的表達(dá)：小鼠肝組織滴加山羊血清封閉液，放置于濕盒中，在室溫條件下孵育15min。在切片上滴加RhoA，Rho-kinase抗體4℃冰箱條件下過(guò)夜；再室溫情況靜置3h，PBS反復(fù)洗滌各組切片10min×4次。分組滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫下孵育20min，PBS充分洗滌15min×3次；洗滌后采用DAB顯色，并蘇木素染核，染色成果后逐一封片。

1.2.6.3 RhoA，Rho-kinase陽(yáng)性表現(xiàn)情況：肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。光學(xué)高倍鏡下，每張切片上隨機(jī)至少抽取8個(gè)完整并相互不重疊視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的IOD值，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 小鼠狀態(tài) 建模8周后，正常對(duì)照組的小鼠進(jìn)食正常，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏；肝臟外觀色澤飽滿(mǎn)，邊緣銳利，表面光滑，呈現(xiàn)正常肝臟形態(tài)。模型組、給藥組小鼠均對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，欠活潑，進(jìn)食量明顯減少。建模期間，模型組、給藥組分別死亡2只。

2.2 肝組織影像學(xué)檢測(cè)

2.2.1 二維超聲模式：采用二維超聲模式分別對(duì)各組小鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)、回聲改變等進(jìn)行逐一檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果提示，正常對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，肝實(shí)質(zhì)回聲均勻，彌漫性細(xì)顆粒狀，肝內(nèi)膽管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰。而模型組小鼠肝臟表面欠光滑，呈現(xiàn)出小結(jié)節(jié)樣改變，肝內(nèi)回聲增粗、變強(qiáng)，肝內(nèi)膽管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)混亂，難以鑒別。而經(jīng)過(guò)阿魏酸鈉干預(yù)后，給藥組小鼠肝臟表面見(jiàn)光滑，肝臟組織實(shí)質(zhì)回聲改變均較模型組有明顯減輕。

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

2.2.2 超聲彈性成像模式：在超聲彈性成像技術(shù)下，各試驗(yàn)組小鼠肝臟組織超聲彈性成像技術(shù)下改變情況見(jiàn)圖2。正常對(duì)照組小鼠肝臟主要為綠色，少部分呈現(xiàn)藍(lán)色，其中紅色部分系肝葉組織間隙和肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)。模型組小鼠肝臟中主要呈現(xiàn)大量藍(lán)色，綠色和紅色占比少，而經(jīng)阿魏酸鈉干預(yù)后的給藥組，其藍(lán)色比模型組顯著減少，趨近正常對(duì)照組影像。

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

2.3 肝臟硬度值 與正常對(duì)照組和給藥組比較，模型組小鼠肝臟的硬度值均明顯增強(qiáng)。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，得出經(jīng)阿魏酸鈉干預(yù)后，小鼠肝纖維化程度可有明顯減輕。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝臟硬度值對(duì)比

2.4 肝功能檢測(cè)和肝纖維化指標(biāo) 模型組小鼠肝功能指標(biāo)(AST、ALT)對(duì)比正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；阿魏酸鈉給藥后可見(jiàn)降低(P<0.05)。模型組小鼠4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)對(duì)比正常對(duì)照組(PⅢP、HA、CⅣ和LN)有顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝功能和肝纖維化指標(biāo)

2.5 肝臟組織病理學(xué)染色 小鼠肝臟組織HE染色和Masson三色染色結(jié)果表明，正常對(duì)照組肝臟組織結(jié)構(gòu)有序正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，沒(méi)有出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生和脂肪變性、壞死現(xiàn)象，是正常肝臟病理形態(tài)。模型組發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織中出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象，肝匯管區(qū)、肝小葉及肝竇結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出嚴(yán)重紊亂，可見(jiàn)顯著纖維結(jié)締組織增生，并可見(jiàn)膠原物質(zhì)沉積。給藥組肝纖維化明顯有改善，膠原物質(zhì)沉積較模型組明顯減輕。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

2.6 小鼠肝臟組織內(nèi)RhoA、Rho-kinase的含量 模型組小鼠肝臟組織內(nèi)RhoA表達(dá)均高于其他兩組。采用阿魏酸鈉干預(yù)后，肝硬化小鼠肝臟RhoA的表達(dá)見(jiàn)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。阿魏酸鈉干預(yù)后，模型組小鼠肝臟Rho-kinase的含量見(jiàn)減低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

3 討論

CCl4系一種常見(jiàn)的具有選擇性肝毒性化學(xué)物質(zhì)，其通過(guò)活化HSC，達(dá)到誘導(dǎo)肝臟正常組織向纖維化轉(zhuǎn)變進(jìn)程[10]?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，各種類(lèi)型肝臟損害常常呈現(xiàn)出肝纖維化這一共同病理征象[11]，其是一種早期并且具有可逆的肝臟損害，如臨床上能及早干預(yù)，常能表現(xiàn)出一定的修復(fù)潛力[12]。因此，早期預(yù)防和及早干預(yù)是阻止肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵[13]，但研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，且多種細(xì)胞、細(xì)胞因子等參與疾病進(jìn)程，因此探索研究抑制肝纖維化進(jìn)程，并能使其減退的抗纖維化藥物具有極高價(jià)值[13]。本研究顯示阿魏酸鈉能夠有效抑制小鼠肝臟組織纖維化，其影像學(xué)指標(biāo)(形態(tài)結(jié)構(gòu)、回聲改變、彈性、硬度)、肝功能指標(biāo)(AST、ALT)和肝纖維化指標(biāo)(HA、LN、CⅣ、PⅢP)，并結(jié)合其肝臟組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉治療下，能夠有效改善小鼠肝臟纖維化變程度以及膠原沉積范圍；聯(lián)合免疫組化檢測(cè)下肝臟組織中RhoA，Rho-kinase的含量，發(fā)現(xiàn)模型組RhoA及Rho-kinase水平都明顯高于正常對(duì)照組和給藥組，因此能較為全面地證明阿魏酸鈉具有保護(hù)肝臟組織和抑制肝纖維化的作用。RhoA和Rho-kinase體現(xiàn)為活化的HSC中表達(dá)[14]，并參與HSCs激活及肝臟纖維化進(jìn)展，該信號(hào)通道通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張及收縮，從而發(fā)揮促進(jìn)HSC活化的作用，并導(dǎo)致肝細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)過(guò)度纖維化增生[15]。只有活化狀態(tài)RhoA(GTP-RhoA)才能發(fā)揮激活Rho-kinase并誘發(fā)其下游效應(yīng)。RhoA和Rho-kinase含量的顯著減少，提示由RhoA活化并引起的下游效應(yīng)受到抑制。GGPP為RhoA起活化的重要因素[16]，阿魏酸鈉極有可能通過(guò)抑制GGPP生產(chǎn)，從而抑制RhoA和Rho-kinase通路的激活[17]。

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

正常對(duì)照組 模型組 給藥組

綜上所述，本研究不僅證實(shí)了阿魏酸鈉對(duì)CCl4-花生油誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有抑制作用，而且通過(guò)分子生物學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸鈉發(fā)揮抗肝纖維化作用的機(jī)制可能是通過(guò)抑制RhoA和Rho-kinase信號(hào)通路的激活，降低GGPP、α-SMA、α-SMA、ROCK、eNOS、Colla-genI、Colla-genⅢ的表達(dá)[18]，調(diào)節(jié)TIMP/MMP的平衡，抑制HSCs的激活，降低ECM的合成來(lái)發(fā)揮作用的。