“精油+有機酸”復合微膠囊制劑對肉鴨免疫指標、腸道組織形態(tài)和盲腸菌群的影響

■陳文忠 李英英 張謀炎 莊曉東 郭 慶，*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，福建福州 350003；3.福建農(nóng)林大學動物科學學院（蜂學學院），福建福州 350002；4.福建省華龍集團飼料有限公司，福建福州 350003）

植物精油（Essential oil）又稱揮發(fā)油（Volatile oil）或香精油（Etheral oil），是從植物中提取的揮發(fā)性油類，目前已廣泛應用于化妝品、藥品和食品中。隨著對植物精油研究的深入，其抗菌[1-2]、抗氧化[3]、抗病毒[4-5]、抗蟲[6-7]和抗炎[8]等作用也得到證實，這些作用與畜禽養(yǎng)殖中抗生素的作用類似。同時，植物精油還具有安全性高、副作用小、成本低、資源豐富等優(yōu)點[9]，目前已作為抗生素的替代物廣泛添加于動物飼料中[10]。有機酸是一種無抗藥性、無殘留、無毒副作用的綠色環(huán)保型飼料添加劑，添加于飼料中有如下作用[11]：①調(diào)節(jié)胃內(nèi)pH，促進營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收；②參與機體的檸檬酸代謝，為機體提供能量；③抑制和殺滅有害菌，促進有益菌的生長，進而改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)。有機酸已經(jīng)與植物精油、微生態(tài)制劑、益生菌等新型飼料添加劑一起，得到畜牧界的廣泛關(guān)注，被視為抗生素替代物之一。

植物精油和有機酸常聯(lián)合應用于飼料生產(chǎn)中，并為畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來了較為顯著的效益[12-13]。但大部分植物精油和有機酸因性質(zhì)極不穩(wěn)定、易分解變質(zhì)和散失揮發(fā)等問題而嚴重影響了產(chǎn)品的應用和功效。通過微膠囊包被緩釋技術(shù)可以較好地解決這些問題，將精油和有機酸混合包被，形成圓形小顆粒具有流動性好、不揚塵、清潔衛(wèi)生、使用便捷等優(yōu)點[14]；同時，可以降低精油和有機酸與其他添加劑直接接觸，提高其穩(wěn)定性，減少揮發(fā)，使其能在腸道中緩慢釋放，均勻分布于整個腸道，調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境，促進營養(yǎng)吸收[15-17]。植物精油和有機酸包被復合物作為飼料添加劑在肉雞和蛋雞中都已取得了較好的效果[18-20]。前期已通過試驗證實，在肉鴨飼糧中添加“精油+有機酸”復合微膠囊制劑(microencapsulated organic acids and essential oils, MOAEO)可提高肉鴨的生長性能，改善肉鴨血清生化指標和屠宰性能，提高肌肉品質(zhì)。但MOAEO 對肉鴨免疫力、腸道組織形態(tài)和菌群結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。本試驗通過在肉鴨飼糧中添加MOAEO, 測定其對肉鴨免疫學指標、腸道組織形態(tài)和盲腸菌群的影響，為該添加劑在肉鴨生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MOAEO 購自意大利Vetagro S.p.A.公司，其成分和含量為：檸檬酸25.0%、山梨酸16.7%、百里香酚1.7%、香蘭素1.0%、脂肪55.6%。

1.2 試驗動物及飼喂管理辦法

試驗肉鴨由漳州昌龍農(nóng)牧有限公司程溪種禽基地提供，選取900 只體況及體重相近的1 日齡櫻桃谷肉鴨（公），隨機分成5 組，每組6 個重復，每個重復30只。對照組飼喂基礎飼糧，基礎飼糧組成與營養(yǎng)水平見表1，Ⅰ組為抗生素對照組，在基礎飼糧中添加40 mg/kg 桿菌肽鋅，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別在基礎飼糧中添加100、200、300 mg/kg MOAEO。試驗期間采取自由采食、自由飲水，日常管理和免疫按常規(guī)程序進行，試驗周期為42 d。

表1 基礎飼糧組成與營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 指標測定

試驗第42 天，從每重復中選取2 只體質(zhì)健康、體重相近并接近平均體重的肉鴨，稱重后屠宰，用于測定肉鴨的免疫指標、消化道組織形態(tài)和盲腸菌群。

1.3.1 免疫指標測定

1.3.1.1 免疫器官指數(shù)測定

取屠宰后的肉鴨，摘取胸腺、脾臟和法氏囊，剝離脂肪后稱重，計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重(g)/體重(kg)

1.3.1.2 十二指腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量測定

取屠宰后的肉鴨，剝離出十二指腸，用滅菌生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物后濾紙吸干殘余水分，刮取腸黏膜后稱重，按黏膜重：磷酸鹽緩沖液體積為1∶2的比例加入0.01 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，4 ℃靜置30 min，冰浴超聲5 min，4 ℃12 000 r/min 離心20 min，取上清液用于測定十二指腸黏膜sIgA 含量[22]。十二指腸黏膜sIgA 含量測定使用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的sIgA ELISA檢測試劑盒，操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.2 腸道組織形態(tài)觀察

取屠宰后的肉鴨，剪取腸道（十二指腸、空腸和回腸），用4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，H.E.染色。用Nikon Eclipse E100 顯微鏡進行鏡檢，并用Motic Images Advanced 3.2 軟件測定絨毛高度和隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度（V/C）。

1.3.3 盲腸菌群觀察

取新鮮盲腸內(nèi)容物1 g，用滅菌生理鹽水100 倍稀釋，振蕩混合均勻；再用生理鹽水10 倍比稀釋至10-7。選取3 個適宜稀釋度分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和改良MRS 培養(yǎng)基，采用平板菌落計數(shù)法進行統(tǒng)計，測定盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸菌的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和多重比較（LSD），結(jié)果用“平均數(shù)±標準差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MOAEO對肉鴨免疫指標的影響

2.1.1 MOAEO對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，Ⅰ組肉鴨的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)都極顯著高于對照組（P＜0.01）；Ⅲ、Ⅳ組的胸腺指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），脾臟指數(shù)也高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，Ⅱ組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)以及4 個試驗組的法氏囊指數(shù)都有提高，但差異不顯著（P＞0.05）。3個MOAEO試驗組中Ⅲ組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)都高于其他兩組，其脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)都與抗生素組（Ⅰ組）無顯著差異（P＞0.05），僅胸腺指數(shù)與抗生素組差異顯著（P＜0.05）。

表2 MOAEO對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響（g/kg，n=12）

2.1.2 MOAEO對肉鴨十二指腸黏膜sIgA含量的影響

如表3 所示，與對照組相比，各試驗組十二指腸黏膜sIgA 含量都有提高，Ⅰ、Ⅲ組極顯著提高（P＜0.01），Ⅱ、Ⅳ組顯著提高（P＜0.05）。3 個MOAEO 試驗組的十二指腸黏膜sIgA 含量與抗生素組均無顯著差異（P＞0.05），其中Ⅲ組的含量最高，與抗生素組最接近。

表3 MOAEO對肉鴨十二指腸黏膜sIgA含量的影響（μg/mL，n=12）

2.2 MOAEO對肉鴨腸道組織形態(tài)的影響

由表4 可知，在十二指腸段，Ⅰ組的腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05），3個MOAEO試驗組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；抗生素組和3 個MOAEO 試驗組的隱窩深度與對照組相比均有下降，但差異不顯著（P＞0.05）；Ⅲ組的V/C 值比對照組顯著提高（P＜0.05），其余各組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。在空腸段，Ⅰ、Ⅲ組的腸絨毛高度與對照組差異極顯著（P＜0.01），Ⅱ、Ⅳ組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；3 個MOAEO 試驗組的隱窩深度均低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；抗生素組和3個MOAEO試驗組的V/C值與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。在回腸段，Ⅰ組的腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ組極顯著高于對照組（P＜0.01）；Ⅰ、Ⅲ組的隱窩深度與對照組差異顯著（P＜0.05）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組的V/C 值與對照組差異顯著（P＜0.05），Ⅲ組與對照組差異極顯著（P＜0.01）。3個MOAEO試驗組中Ⅲ組肉鴨三個腸段的腸絨毛高度均最高，隱窩深度最低，V/C 值也最高，與抗生素組差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 MOAEO對肉鴨腸道組織形態(tài)的影響（n=12）

2.3 MOAEO對肉鴨盲腸菌群的影響

由表5 可知，抗生素組和3 個MOAEO 試驗組的盲腸大腸桿菌含量均低于對照組，但與對照組差異不顯著（P＞0.05）；3個MOAEO試驗組的盲腸乳酸菌的含量均高于對照組，而抗生素組的含量低于對照組，其中Ⅲ、Ⅳ組顯著高于對照組（P＜0.05），極顯著高于抗生素組（P＜0.01）。

表5 MOAEO對肉鴨盲腸菌群的影響[lg(CFU/g)，n=12]

3 討論

3.1 MOAEO對肉鴨免疫指標的影響

3.1.1 MOAEO對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是禽類的主要免疫器官，免疫器官指數(shù)的高低，通常被作為評判禽類免疫功能好壞的一個重要指標。研究表明，在動物飼糧中添加精油和有機酸，可刺激免疫器官發(fā)育，提高免疫器官指數(shù)，增強機體免疫力。朱曉磊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.35 mg/kg 百里香精油可以顯著提高肉雞胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)。王淑琴等[24]也發(fā)現(xiàn)高劑量檸檬酸組肉仔雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)以及法氏囊指數(shù)均有所提高。劉嬌等[25]的研究表明，在大腸桿菌攻毒的肉鴨飼糧中添加植物精油可顯著提高14日齡肉鴨法氏囊指數(shù)，增強機體免疫力，緩解肉鴨體內(nèi)大腸桿菌引起的炎癥反應。本試驗中，在肉鴨飼糧中添加桿菌肽鋅可極顯著提高肉鴨的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；3 個MOAEO 添加組中肉鴨的免疫器官指數(shù)也均有提高，添加劑量為200 mg/kg和300 mg/kg的兩組肉鴨胸腺指數(shù)顯著高于對照組；3個MOAEO添加組的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)雖與對照組差異不顯著，但呈上升趨勢，且添加劑量為200 mg/kg時效果優(yōu)于其他兩個組，其免疫器官指數(shù)與桿菌肽鋅組最接近。該結(jié)果與前期試驗中在肉鴨飼糧中添加MOAEO可提高肉鴨生產(chǎn)性能的結(jié)果一致，也與以往報道中精油和有機酸可提高機體免疫器官指數(shù)、增強機體免疫力的結(jié)論基本一致。

3.1.2 MOAEO對肉鴨十二指腸黏膜sIgA含量的影響動物腸道是機體與外界環(huán)境直接連接的通道，長期與大量的病原微生物接觸，是抵御病原微生物經(jīng)消化道途徑入侵體內(nèi)的第一道屏障。構(gòu)成這道屏障的主要物質(zhì)基礎是腸道黏膜免疫系統(tǒng)，而黏膜免疫的主要效應因子是sIgA，sIgA 在腸道黏膜免疫中維持腸道黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，它不僅具有中和病毒、抑制微生物吸附的作用，還具有免疫排斥和促天然抗菌因子的功能，通過干擾病原體與上皮細胞受體的結(jié)合，免疫排異清除病原體和降低病菌毒力，從而實現(xiàn)對機體的免疫保護[26]。sIgA 在腸道黏膜免疫中作用重要，因此常用腸黏膜sIgA 含量評價動物免疫狀態(tài)[27-29]。晏家友等[30]認為，在斷奶仔豬飼糧中添加復合酸化劑可降低腸道pH，刺激漿細胞分泌sIgA，進而提高腸黏膜內(nèi)sIgA 的含量；張杏莉[31]在肉雞飼糧中添加“精油+有機酸”微囊包被制劑，發(fā)現(xiàn)肉雞十二指腸黏膜sIgA 含量也顯著提高；姜維等[32]的研究表明，在飼糧中添加適量的薰衣草精油，可使肉仔雞腸道sIgA 含量與飼喂抗生素組無顯著差異。本試驗中，3 個MOAEO 添加組十二指腸黏膜sIgA 含量都顯著高于對照組，且200 mg/kg添加組含量最高，與桿菌肽鋅抗生素組接近，說明在飼糧中添加適量的MOAEO可提高肉鴨腸道免疫力，改善肉鴨腸道健康，其效果與抗生素桿菌肽鋅接近。但目前關(guān)于精油或有機酸對腸黏膜sIgA含量影響的研究較少，其作用機理有待進一步研究。

3.2 MOAEO對肉鴨消化道組織形態(tài)的影響

作為動物機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，小腸功能的正常發(fā)揮與其組織形態(tài)的變化有著緊密的聯(lián)系，環(huán)境條件和營養(yǎng)水平對小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響主要是通過絨毛高度、隱窩深度和兩者比值的變化反映出來的[33]。小腸絨毛高度的變化直接影響小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，接觸面積越大其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率越高；而隱窩的深淺與小腸內(nèi)皮細胞的生存率成反比，小腸隱窩越淺，細胞的成熟率越高，其分泌消化液的能力越強，對飼料的消化能力越高[34]，只有成熟的絨毛細胞才具有吸收養(yǎng)分的功能[35]。而小腸絨毛高度和隱窩深度的比值（V/C）則綜合反映出小腸的功能狀況，比值越高，代表小腸黏膜發(fā)育越好，吸收功能越強，相反地，比值越低其消化吸收能力也越低，生長發(fā)育減慢。已有研究表明，在飼糧中添加有機酸或植物精油可提高動物腸絨毛高度、降低隱窩深度，提高V/C 值，改善腸道組織形態(tài)、提高生產(chǎn)性能。余建等[36]的研究表明，飼糧中添加有機酸可提高斷奶仔豬腸絨毛高度和V/C值，降低仔豬的斷奶應激，提高生產(chǎn)性能；劉洋等[37]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加100 mg/kg 肉桂醛可顯著提高腸絨毛高度和V/C 值，降低隱窩深度；Castillo 等[38]報道，肉桂醛可促進早期斷奶仔豬的腸絨毛生長。本試驗結(jié)果表明，三個MOAEO添加組肉鴨的十二指腸、空腸、回腸的絨毛均變長，隱窩深度變淺，其中200 mg/kg添加組的改善效果最顯著。在十二指腸段，200 mg/kg MOAEO添加組肉鴨的腸道V/C 值顯著高于對照組；在空腸段，該組的腸絨毛高度極顯著增加；在回腸段，該組的腸絨毛高度和V/C值均極顯著高于對照組，隱窩深度顯著降低。與桿菌肽鋅添加組相比，200 mg/kg MOAEO添加組肉鴨的回腸絨毛高度也顯著增加。說明飼糧中添加適量的MOAEO 有利于肉鴨腸道發(fā)育，促進腸絨毛生長，增大腸道吸收面積從而促進其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；其對腸道發(fā)育的促進作用優(yōu)于抗生素桿菌肽鋅。其作用機理可能是精油和有機酸影響了肉鴨腸道pH，改變了腸道微生態(tài)環(huán)境，進而影響腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)[39-40]。

3.3 MOAEO對肉鴨盲腸菌群的影響

家禽盲腸是微生物生存和活動的重要場所，有益菌在宿主腸道可通過占位、爭奪營養(yǎng)、改變生存環(huán)境（如降低氧氣量和pH）等方法抑制病原微生物的增殖，建立腸道生物屏障，對維持腸道健康起著重要作用。研究表明，在動物飼糧中添加酸化劑，可降低胃腸道pH，不利于大腸桿菌等有害菌生存繁殖，而有利于乳酸菌等有益菌的增殖[11，41-42]。精油可通過破壞或降解細胞壁和破壞細胞質(zhì)膜等作用機制，來減少有害菌的數(shù)量，促進有益菌的增殖。在飼糧中添加植物精油可促進動物腸道內(nèi)有益菌的生長，抑制有害菌的生長，改善腸道菌群，進而提高其消化吸收能力[43-47]。本試驗中，雖然MOAEO 試驗組僅乳酸菌數(shù)量與對照組差異顯著，而大腸桿菌差異不顯著，但添加MOAEO后肉鴨盲腸大腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢，乳酸菌數(shù)量呈上升趨勢，而且隨著劑量的增加，大腸桿菌數(shù)量逐漸減少，乳酸菌數(shù)量逐漸增多，該結(jié)果與以往有機酸和植物精油可促進有益菌生長、抑制有害菌生長、改善動物腸道菌群平衡的結(jié)論基本一致。而桿菌肽鋅抗生素組肉鴨盲腸中大腸桿菌及乳酸菌數(shù)量均低于對照組，且乳酸菌數(shù)量極顯著低于200 mg/kg MOAEO 添加組，說明MOAEO 對腸道菌群的改善調(diào)節(jié)途徑與抗生素不同，飼糧中添加MOAEO 更有利于維持動物腸道微生態(tài)平衡。

4 結(jié)論

飼糧中添加MOAEO 能夠提高肉鴨免疫器官指數(shù)和十二指腸黏膜sIgA 含量，提高免疫力；改善腸道組織形態(tài)，促進盲腸乳酸菌增殖，提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，可作為抗生素的替代物添加于肉鴨飼糧中，適宜添加量為200 mg/kg。