BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法優(yōu)化嘔吐毒素降解菌發(fā)酵培養(yǎng)基

■杜 穩(wěn) 孫 晶 趙一凡 孫長坡 尹 鵬 劉虎軍*

(1.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037；2.國家糧食與物資儲備局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心，北京 100037)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）又稱嘔吐毒素，是一種由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族劇毒次級代謝產(chǎn)物，主要在作物生長、儲藏、加工等環(huán)節(jié)造成污染[1-2]。DON 污染嚴(yán)重影響了糧食、飼料以及相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)及質(zhì)量安全，對人和動物的生命健康造成重大威脅。研究表明，長期暴露于低劑量的DON 下，人和動物會產(chǎn)生慢性不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[3-6]，當(dāng)攝入過量的DON，會出現(xiàn)急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致直接死亡[7-8]。因此，去除糧油及飼料中的DON意義重大。

德沃斯氏菌（Devosiasp.）屬好氧型或者兼性厭氧型革蘭氏陰性菌，于1996 年由Nakagawa 等[9]根據(jù)16S rRNA序列分析和化學(xué)分類方法進(jìn)行歸類劃分。近年研究表明該菌可以高效降解DON[10]，可以產(chǎn)生兩種降解酶（DepA和DepB），其中DepA作為氧化酶，DepB作為還原酶，作用于DON的3位羥基，使DON發(fā)生異構(gòu)化，形成具有低毒性的DON異構(gòu)體（3-epi-DON），從而達(dá)到安全高效降解DON的效果[11-14]。此外，動物毒理性和安全性評價(jià)表明德沃斯氏菌低毒且安全，動物有效性評價(jià)表明它可以有效緩解DON引起的平均日增重和平均日采食量降低、肝臟腫大等癥狀[10，15]。目前，對德沃斯氏菌的發(fā)酵工藝研究相對較少，因此，提高菌株發(fā)酵生物量，將該菌應(yīng)用于飼料中的DON降解，在畜牧生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Back propagation neural network）是一種多層前反饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以實(shí)現(xiàn)從輸入到輸出的任意非線性映射[16]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）是依據(jù)達(dá)爾文的“適者生存”學(xué)說發(fā)展起來的一種組合優(yōu)化算法，它將一組變量進(jìn)行二進(jìn)制編碼，并將這些編碼排列組合，形成基因鏈，并定義為個(gè)體，將一定量的個(gè)體形成種群，并在種群中將各個(gè)體進(jìn)行選擇、交叉、變異等操作來實(shí)現(xiàn)遺傳機(jī)制，以適應(yīng)度函數(shù)作為評價(jià)依據(jù)，不斷進(jìn)行迭代進(jìn)化，逐漸逼近并得到最優(yōu)解[17-19]。將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與GA進(jìn)行耦合，可以在試驗(yàn)變量組成的多維空間立體范圍內(nèi)進(jìn)行全局尋優(yōu)，從而使優(yōu)化過程更加快速精準(zhǔn)，結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性。雷虹等[20]通過該方法優(yōu)化細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后細(xì)菌纖維素產(chǎn)量提高了1.18倍，王云龍等[21]通過該對L-天冬酰胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，酶活較優(yōu)化前提高了90.9%。

在之前的工作中，本團(tuán)隊(duì)篩選獲得了一株高效降解DON的德沃斯氏菌D-8[22]，為提高該菌發(fā)酵培養(yǎng)的生物量，本研究通過單因素、正交試驗(yàn)以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA 等對該菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得發(fā)酵培養(yǎng)該菌株的最佳培養(yǎng)基，為該菌的后期工業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

降解DON的德沃斯氏菌D-8，由國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油加工研究所糧油真菌毒素防控實(shí)驗(yàn)室提供。

活化培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 試劑及儀器

酵母浸粉、蛋白胨，Thermo Fisher Scientific公司；NaCl、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4，國藥集團(tuán)。

Ecotron 型恒溫?fù)u床，瑞士Infors 公司；HV-110型滅菌鍋，日本NIRAYAMA 公司；Evolution 300 紫外可見分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher 公司；PP60 型pH計(jì)，德國Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與種子液的制備

將保藏于-80 ℃冰箱的D-8菌種取出，室溫解凍后在活化培養(yǎng)平皿上進(jìn)行三區(qū)劃線復(fù)蘇，30 ℃培養(yǎng)16 h。將復(fù)蘇的D-8 單菌落轉(zhuǎn)劃到新的活化培養(yǎng)基平皿上，30 ℃培養(yǎng)48 h 后挑取單菌落接到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，獲得種子液。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件及生物量的測定

將種子液以5%的接種量接到無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)30 h，發(fā)酵結(jié)束后測定培養(yǎng)液生物量，并以O(shè)D600nm表示。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.3.1 碳源、氮源的篩選

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定氮源與無機(jī)鹽，分別添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、麥芽糊精、甘油、麩皮、糖蜜作為碳源，研究不同碳源對D-8菌生長的影響。

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定最佳碳源（20 g/L添加量）與無機(jī)鹽，分別選擇添加10 g/L 的有機(jī)氮源（胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、月示蛋白胨、魚蛋白胨）、無機(jī)氮源（硫酸銨、尿素）、生物復(fù)合氮源（玉米漿干粉、棉籽餅粉、花生餅粉、黃豆餅粉）作為氮源，研究不同氮源對D-8菌生長的影響。

發(fā)酵生物量以O(shè)D600nm作為檢測指標(biāo)，以添加不同碳源、氮源的培養(yǎng)基作為對照，含有生物復(fù)合氮源的發(fā)酵液1 000 r/min 離心10 s 去除不溶沉淀后進(jìn)行OD600nm檢測。

1.3.3.2 碳源、氮源最佳添加量的優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基固定無機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，選擇最佳氮源（10 g/L 添加量），分別將最佳碳源設(shè)定10、15、20、25、30、35 g/L 和40 g/L，研究最佳碳源添加量對D-8菌生長的影響。在固定無機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，選擇最佳碳源及添加量，分別將最佳氮源設(shè)定為5、10、15、20、25 g/L 和30 g/L，研究最佳氮源不同添加量對D-8 菌生長的影響。

1.3.3.3 無機(jī)鹽和微量元素主要因子篩選試驗(yàn)

基于碳源、氮源的優(yōu)化結(jié)果，選取NaCl、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4等7 個(gè)因素，各因素分別設(shè)計(jì)高低兩個(gè)水平，采用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與模型的建立，篩選影響D-8 菌生長的主要因素。7個(gè)因素的編碼及水平見表1。

表1 無機(jī)鹽及微量元素部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.4 無機(jī)鹽及微量元素最佳添加量優(yōu)化

在最佳碳源、氮源及最佳添加量的基礎(chǔ)上，選擇無機(jī)鹽和微量元素主要影響因素，分別設(shè)置KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 添加量為1、2、3、4、5、6、7、8 g/L，確定各因素的最佳添加量。

1.3.3.5 正交試驗(yàn)

將篩選出的碳源、氮源、無機(jī)鹽作為變量，選擇4 因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素及水平見表2。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)出的不同組別進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

表2 各因素正交表L9（34）（g/L）

1.3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及GA優(yōu)化尋優(yōu)

使用Python 2.7 軟件，以正交試驗(yàn)和結(jié)果作為訓(xùn)練和測試數(shù)據(jù)樣本，根據(jù)培養(yǎng)基各組分和發(fā)酵生物量確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入輸出，構(gòu)建BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并用GA 對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的初始權(quán)值和閾值進(jìn)行優(yōu)化，通過對培養(yǎng)基各因素全局尋優(yōu)確定最佳培養(yǎng)基配比。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為0.05；3組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析的Duncan’s法進(jìn)行兩兩比較，顯著性水平同樣設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源、氮源的篩選

不同碳源對D-8 菌生長的影響結(jié)果如圖1a 所示，糖蜜作為碳源時(shí)，D-8 菌的生物量顯著高于其他碳源（P＜0.05），OD600nm為10.36；其次為蔗糖，說明以蔗糖為主的碳源更有利于該菌的生長。不同氮源對D-8菌生長的影響結(jié)果如圖1b所示，當(dāng)酵母浸粉作為氮源時(shí)，D-8 菌的生物量顯著高于其他氮源（P＜0.05），OD600nm為9.39。而利用無機(jī)氮源及其他有機(jī)氮源效果相對較差，說明其利用大蛋白能力及氮轉(zhuǎn)化能力較弱。

圖1 碳源、氮源的篩選

2.2 碳源、氮源最佳添加量的優(yōu)化

碳源的最佳添加量由圖2a 可見，隨著糖蜜添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)糖蜜添加量為25 g/L時(shí)生物量最大，OD600nm為12.49，隨著糖蜜添加量的繼續(xù)增加，生物量逐漸下降，由此可見，糖蜜的適宜添加范圍為20～30 g/L。氮源的最佳添加量由圖2b可見，隨著酵母浸粉添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)?shù)刺砑恿繛?0 g/L 時(shí)生物量最大，OD600nm為12.62，隨著酵母浸粉添加量的增加，生物量逐漸下降。由此可見，酵母浸粉的適宜添加范圍為10～20 g/L。

圖2 碳源、氮源最佳添加量

2.3 無機(jī)鹽和微量元素主要影響因子篩選試驗(yàn)

為避免在后期優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源，采用多因素部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)從眾多因素中快速有效地篩選出對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素。采用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行多因素部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，各因素的主要效應(yīng)分析見表4。通過方差分析，模型的F值為5.21，P＜0.05，表明模型顯著。根據(jù)P值可以看出，各無機(jī)鹽及微量元素的顯著因素為B（KH2PO4）、C（K2HPO4）、D（Na2HPO4·12H2O）。根據(jù)方差分析得到各因素的回歸方程：Y=9.105 13-0.318A+0.597B-0.54C+0.652D-0.206E-0.358F-0.04G。由方程各因素系數(shù)可見，K2HPO4為負(fù)效應(yīng)，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 為正效應(yīng)，所以對這兩個(gè)正效應(yīng)因素進(jìn)行研究。

表3 主要因子篩選兩水平部分試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 主要因子篩選試驗(yàn)結(jié)果顯著性分析

2.4 無機(jī)鹽最佳添加量優(yōu)化

無機(jī)鹽的最佳添加量如圖3所示，隨著KH2PO4添加量的增加，D-8 菌的生物量隨之增加，當(dāng)其添加量為4 g/L 時(shí)，生物量達(dá)到最大值，OD600nm為12.55，此后逐漸下降。隨著Na2HPO4·12H2O 添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)其添加量為6 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值，OD600nm為13.4，此后逐漸下降。通過單因素優(yōu)化后，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的最佳添加量分別為4 g/L 和6 g/L，KH2PO4的添加范圍為3～5 g/L，Na2HPO4·12H2O的添加范圍為5～8 g/L。

圖3 無機(jī)鹽最佳添加量

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

以D-8 菌發(fā)酵后的生物量（OD600nm）為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以獲得各組分在不同濃度下的試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，結(jié)果見表5。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，第6 組試驗(yàn)的發(fā)酵結(jié)果最佳，D-8 菌的最大生物量為13.778。根據(jù)極差可以看出4 個(gè)因素對D-8菌生長的影響主次順序分別為糖蜜＞KH2PO4＞酵母浸粉＞Na2HPO4·12H2O。

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，因?yàn)?因素的正交表試驗(yàn)誤差自由度為1，各因素變異來源的F值不靈敏且不顯著，通過分析正交試驗(yàn)結(jié)果，Na2HPO4·12H2O添加量變化對試驗(yàn)結(jié)果的波動影響最小，所以將該因素的各變異項(xiàng)的離差平方和和自由度并入誤差項(xiàng)的平方和及自由度，從而提高假設(shè)檢驗(yàn)的靈敏度，通過方差分析，結(jié)果見表6。由表6 可見，糖蜜添加量變化對D-8菌的生長具有顯著性（P＜0.05），酵母浸粉和KH2PO4的添加量變化對D-8菌的生長不顯著（P＞0.05）。

表6 D-8菌發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析

2.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA優(yōu)化最佳培養(yǎng)基配方

2.6.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

在正交試驗(yàn)中，各個(gè)因素濃度梯度設(shè)置較大，為更加快速、精準(zhǔn)地優(yōu)化各組分的最佳配比，以發(fā)酵培養(yǎng)基組分（糖蜜、酵母浸粉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O）作為BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入神經(jīng)元，以發(fā)酵后D-8 菌的生物量（OD600nm）作為輸出神經(jīng)元，以表5 中9 組正交試驗(yàn)及結(jié)果作為訓(xùn)練集，構(gòu)建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為4-N-1 的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。將變量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，收斂精度在[0,1]之間，輸入層-隱含層以tansig函數(shù)傳遞，隱含層-輸出層以pureline 函數(shù)傳遞，訓(xùn)練函數(shù)為梯度下降函數(shù)trainlm，設(shè)置最大迭代次數(shù)1 000 次，學(xué)習(xí)目標(biāo)為10-3，學(xué)習(xí)率為0.1。以訓(xùn)練誤差大小作為指標(biāo)，經(jīng)過訓(xùn)練后，確定隱藏神經(jīng)元節(jié)點(diǎn)數(shù)為10個(gè)，訓(xùn)練擬合決定系數(shù)R2為0.910 88，說明經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能較好地對數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行擬合，實(shí)測值和預(yù)測的結(jié)果見圖4。

圖4 實(shí)測值與預(yù)測值比較

2.6.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA的優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證

R2作為決定系數(shù)評價(jià)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的好壞，R2越接近1，說明構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型越好。在構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的初始權(quán)值和閾值是隨機(jī)產(chǎn)生的，所以為了使構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合更加精確，使用GA優(yōu)化對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值和閾值進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的權(quán)值和閾值，從而構(gòu)建擬合更加精確的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置GA的初始化種群規(guī)模為50，遺傳代數(shù)100代，GA采用ga函數(shù)，經(jīng)過選擇、交叉和變異，通過遺傳迭代57次，適應(yīng)度達(dá)到最大值，誤差平方和達(dá)到最小且趨于穩(wěn)定，迭代曲線見圖5，GA優(yōu)化后得到最佳模型。將培養(yǎng)基4種組分分別選擇合適的步長并進(jìn)行全局尋優(yōu)，在53 361種組合中選擇最大的預(yù)測值即OD600nm為14.53，4種培養(yǎng)基組分為：糖蜜30 g/L，酵母浸粉20 g/L，KH2PO44.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 7 g/L。利用此配方重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，D-8菌的OD600nm為14.68，與預(yù)測值較為接近，說明該優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)模型可以有效地預(yù)測D-8菌的最佳培養(yǎng)基。

圖5 遺傳迭代圖

3 討論

鄒球龍等[23]的研究表明，蔗糖可以作為有效碳源應(yīng)用于德沃斯氏菌的培養(yǎng)基優(yōu)化，本研究中優(yōu)化的最佳碳源為糖蜜，糖蜜中總糖含量為40%～50%，且主要為蔗糖（30%～40%），說明該菌可以很好地利用蔗糖作為碳源，這與鄒球龍等[23]的研究結(jié)果相一致。此外，糖蜜作為碳源較蔗糖效果更佳，分析原因，糖蜜作為蔗糖生產(chǎn)加工的副產(chǎn)物，其主要成分除糖類之外還含有蛋白質(zhì)及豐富的微量元素和活性物質(zhì)[24]，能有效地促進(jìn)該菌的生長；并且在工業(yè)生產(chǎn)中，糖蜜的價(jià)格相較于蔗糖更加低廉，有利于降低發(fā)酵生產(chǎn)成本。優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基中無機(jī)鹽為KH2PO4、Na2HPO4·12H2O，而這兩個(gè)組分是磷酸緩沖液的主要成分；通過優(yōu)化，這兩個(gè)組分以一定比例組合，構(gòu)成了適用于該菌發(fā)酵生長的緩沖體系，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，調(diào)控了發(fā)酵液中的酸堿環(huán)境和滲透壓，從而使D-8菌的發(fā)酵生物量得以增加。

以正交試驗(yàn)及結(jié)果作為訓(xùn)練樣本進(jìn)行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并耦合GA對該模型進(jìn)行優(yōu)化后全局尋優(yōu)，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并以該配方進(jìn)行驗(yàn)證，D-8菌生物量（OD600nm）為14.68，與模型預(yù)測值相差1.01%，說明優(yōu)化后的模型可以有效地預(yù)測該菌株的最佳培養(yǎng)基。該菌培養(yǎng)基優(yōu)化前生物量僅為2.137，正交試驗(yàn)優(yōu)化后生物量為13.778，而BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA優(yōu)化后，生物量是優(yōu)化前的6.87倍，比正交試驗(yàn)提高了6.55%，較正交試驗(yàn)結(jié)果顯著提高（P＜0.05），說明該方法能更為有效地優(yōu)化了D-8 菌的培養(yǎng)基配比。后續(xù)將在此配方的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化及規(guī)?；l(fā)酵放大，以進(jìn)一步提高該菌的生物量，為該菌在糧油加工及飼料生產(chǎn)行業(yè)生物法脫除DON提供有力幫助。

4 結(jié)論

本研究對一株可以降解DON 的德沃斯氏菌D-8進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，以該菌發(fā)酵生物量（OD600nm）作為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和部分因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選并確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽及各組分的濃度范圍。以正交試驗(yàn)及結(jié)果作為訓(xùn)練樣本進(jìn)行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建，并耦合GA對該模型進(jìn)行優(yōu)化后全局尋優(yōu)得到最佳的培養(yǎng)基配比：糖蜜30 g/L、酵母浸粉20 g/L、KH2PO44.4 g/L、Na2HPO4·12H2O 7 g/L，生物量為14.68。該培養(yǎng)基配方為D-8菌株后續(xù)規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。