丁酸鈉與沸石混合添加對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵的影響

■莫慶楠 馮英杰 彭晨慕雪 李裕衛(wèi) 劉昌林 詹周榮 吳國云 臧一天*

（1.江西農業(yè)大學動物科學技術學院，南昌市動物健康與安全生產重點實驗室，江西南昌 330045；2.南昌市農業(yè)科學院，江西南昌 330299；3.景德鎮(zhèn)市農業(yè)科學研究所，江西景德鎮(zhèn) 333000）

人們對雞蛋的需求量日益增大，促使蛋雞養(yǎng)殖產業(yè)規(guī)模不斷擴大。集約化蛋雞養(yǎng)殖已成為主要生產方式，這種養(yǎng)殖方式提高生產效率同時也加劇了禽舍內臭氣的排放[1]。有研究表明氨氣是臭氣中的主要成分，占總臭氣量的70%～90%[2]。氨氣是一種帶刺激性臭味的無色堿性氣體，可損傷蛋雞的呼吸道和眼結膜，增加患病死淘風險[3-4]；同時高濃度氨氣還會降低蛋雞采食量，最終導致產蛋率下降[5]。因此減少蛋雞飼養(yǎng)過程中的氨氣排放十分必要。

目前，主要的蛋雞源頭氨氣減排措施是改善飼糧配比和使用飼料添加劑[5-6]。朱春紅等[6]在研究中提到日糧中添加有機酸可實現(xiàn)氨氣減排目的。丁酸鈉作為有機酸鹽的一種，溶于水時多以丁酸根的形式存在，這點與丁酸類似。目前已有許多相關研究報道丁酸鈉作為減排添加劑的效果，丁酸鈉可以抑制蛋雞盲腸內脲酶和尿酸酶活性，減少尿素和尿酸降解[7]。此外，王安平[1]通過試驗證明，在蛋雞盲腸內容物的體外發(fā)酵試驗中添加0.15%的丁酸鈉減排效果最佳。沸石是一種天然硅鋁酸鹽礦物，具有多孔洞結構，比表面積大，對氨具有吸附性[8-9]。目前沸石常用作飼料添加劑應用于動物生產中，F(xiàn)endri 等[10]研究發(fā)現(xiàn)給蛋雞飼喂含1%或2%沸石的日糧后可有效提高雞蛋品質；而Lon-Wo等[11]的研究更直接表明，在飼糧中添加3%天然沸石可有效降低蛋雞糞便中的氨揮發(fā)。羅一鳴等[12]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，在雞糞堆肥的過程中添加沸石可吸附氨態(tài)氮，減少氨氣揮發(fā)。

王權[13]曾在其研究中提到，在好氧堆肥過程中添加礦物和化學物質可加速堆肥進程減少環(huán)境污染，但單一添加劑的促進作用具有局限性。鐘智康[5]在其試驗的前期研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，單一使用丁酸鈉調控蛋雞減排氨氣的效率僅有24.6%。因此，混合添加使用多種添加劑可能是一個更加高效且經濟的減排方法，這在Wu-Haan 等[14]的研究中得到了印證，在稍微降低粗蛋白的蛋雞日糧中混合添加酸化劑（CaSO4）和沸石可以有效減少氨氣排放，減排效率達39%。而丁酸鈉作為有機酸化劑的一種，常被作為飼料添加劑應用于實際生產中[15]。丁酸鈉很可能也具有促進沸石減少氨氣排放的效果。據(jù)此推測丁酸鈉與沸石混合使用可以更加有效地達到減排目的。但丁酸鈉和沸石混合使用的具體減排效果以及減排的機理并未有相關報道。本研究旨在探究丁酸鈉與沸石混合添加對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵的影響，采用體外發(fā)酵技術，比較不同添加處理后，盲腸內容物體外發(fā)酵的產氨量、脲酶活性、尿素含量以及微生物群落的差異，從而解決混合添加丁酸鈉與沸石是否優(yōu)于單獨添加丁酸鈉或沸石的問題，并嘗試探究丁酸鈉與沸石混合減排的機理。為后續(xù)探究丁酸鈉與沸石混合添加在蛋雞上的應用積累數(shù)據(jù)，并為蛋雞的綠色生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑和設備

丁酸鈉：98%；NH4HCO3：分析純；CoCl2·6H2O：分析純；FeCl2·6H2O：98%；Na2S·9H2O：分析純；刃天青：90%；酒石酸鉀鈉：99%；苯酚鈉：98%（上海麥克林生化科技有限公司）；NaHCO3：分析純；Na2HPO4：分析純；KH2PO4：分析純；CaCl2·2H2O：分析純；MnCl2·4H2O：分析純；NaOH：分析純；H2SO4：分析純；甲苯：分析純；尿素：分析純；次氯酸鈉：分析純（西隴科學股份有限公司）；MgSO4·7H2O：分析純（天津市福晨化學試劑廠）；尿素氮測試盒（C013-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司）；沸石（200目，江西冠菌生物科技有限公司）。

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；氣浴恒溫振蕩搖床（CHA-S，江蘇榮華儀器制造有限公司）；自動雙重水蒸餾器（SZ-93，上海銀澤儀器設備有限公司）；紫外分光光度計（Q/TBCR1，上海精科實業(yè)有限公司）；高速冷凍離心機（Sorvall ST 8R，賽默飛世爾科技）；微型螺旋混合儀（G-560E，Scientific Industries）；電子天平（ATY124，日本島津）；玻璃發(fā)酵瓶（100 mL，徐州乾通玻璃制品有限公司）；超凈工作臺（YJ-VS，無錫一凈凈化設備有限公司）；超低溫冰箱（DW-60W151EU1，青島海爾集團）。

1.1.2 試驗動物與發(fā)酵底物

在江西農業(yè)大學附近農場選購10只30周齡、體重（1.5±0.1）kg、采食產蛋正常的白來航蛋雞用作發(fā)酵菌源制備。同時選取農場使用的無抗蛋雞日糧用作發(fā)酵底物，日糧為粉料形式玉米-豆粕型日糧，且符合中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33—2004）中規(guī)定的營養(yǎng)標準。日糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 蛋雞日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑配制

緩沖溶液：NaHCO3105.00 g，NH4HCO312.00 g，用去離子水定容至3 000 mL。常量元素溶液：Na2HPO45.70 g，MgSO4·7H2O 0.60 g，KH2PO46.20 g，用去離子水定容至1 000 mL。微量元素溶液：MnCl2·4H2O 10.00 g，CaCl2·2H2O 13.20 g，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.80 g，CoCl2·6H2O 1.00 g，用去離子水定容至100 mL。還原劑溶液：Na2S·9H2O 335.00 mg，1 mol/L NaOH 2 mL，用去離子水定容至50 mL。0.1%刃天青溶液：在100 mL去離子水中溶解100.00 mg刃天青。

1.2.2 菌源獲取

根據(jù)江西農業(yè)大學動物實驗倫理要求規(guī)定，將試驗蛋雞肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉后宰殺，立即剖開腹腔，將盲腸近端結扎固定并從結扎外側剪斷。迅速將盲腸取出轉移至超凈工作臺，快速取出所有盲腸內容物并將其混勻，按照1∶3（W∶V）比例加入39 ℃預熱的緩沖溶液充分攪勻，經5 層無菌紗布過濾，濾液在39 ℃下持續(xù)通入CO2制成體外發(fā)酵菌源待用。

1.2.3 試驗分組

丁酸鈉添加量參考王安平[1]在體外發(fā)酵試驗中得出的0.15%最佳添加量；沸石添加量參考Fendri 等[10]和Lon-Wo 等[11]的飼喂試驗，同時考慮采食和消化過程中的損耗，決定添加1.5%沸石，并且通過預試驗驗證了添加1.5%的沸石在體外發(fā)酵中有減少氨氣排放的效果，最終確定沸石添加量為1.5%。試驗分為4組：對照組（CT組），單一丁酸鈉添加組（A組），單一沸石添加組（B 組）及混合添加組（C 組），每組4 個重復。參考王安平[1]的研究方法：干物質消化率按70%計算折算為采食飼料的量。在各處理的發(fā)酵瓶中添加1 000.00 mg 模擬盲腸內容物的粉末，最終折算為添加采食量3 334.00 mg 的日糧作為發(fā)酵底物。A組添加采食飼料質量比0.15%（5.00 mg）的丁酸鈉；B 組添加采食飼料質量比1.5%（50.01 mg）的沸石；C組則混合添加0.15%（5.00 mg）的丁酸鈉和1.5%（50.01 mg）的沸石；CT組不作添加處理。

1.2.4 體外發(fā)酵與樣品采集

體外發(fā)酵產氣技術參考王安平[1]的發(fā)酵方法。

將緩沖溶液預熱至39 ℃，分別量取超純水474 mL，緩沖溶液237 mL，常量元素溶液237 mL，微量元素溶液0.12 mL，刃天青溶液1.22 mL，混合均勻并持續(xù)通入CO210 min，然后加入50 mL還原劑溶液，繼續(xù)通入CO2至溶液無色，制得1 000 mL接種液。將提前制備好的菌源與接種液按體積比1∶2混勻，制得體外發(fā)酵液。

在已加入發(fā)酵底物的發(fā)酵瓶中加入60 mL 上述體外發(fā)酵液，通入CO2排盡瓶中空氣后密封。隨后將密封好的發(fā)酵瓶放置于39 ℃的氣浴恒溫振蕩搖床中，振蕩培養(yǎng)12 h。發(fā)酵結束，將發(fā)酵瓶立即置于冰水終止發(fā)酵。將發(fā)酵瓶中的氣體抽取干凈并通過H2SO4溶液吸收固定氨氣，另外采集10 mL 發(fā)酵液保存于超低溫冰箱用于后續(xù)分析，取樣2 mL 發(fā)酵液于液氮中保存，進行16S rDNA基因高通量測序工作。

1.2.5 樣品指標測定

1.2.5.1 氨氣產量測定

采用納氏比色法，取1 mL硫酸吸收液于試管中，稀釋至25 mL后加入酒石酸鉀鈉1 mL，再加入0.5 mL納氏試劑，混勻后靜置10 min，使用紫外分光光度計420 nm 處測定吸光值。繪制標準曲線后計算各樣品氨氣產量。

1.2.5.2 尿素含量測定

采用南京建成生物工程研究所有限公司的尿素氮測試盒（二乙酰肟比色法），具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.5.3 脲酶活性測定

采用靛酚藍比色法，取1 mL離心上清液加入1 mL甲苯，靜置15 min 后加入10%尿素溶液10 mL、檸檬酸緩沖溶液20 mL?；靹蚝笾糜?7 ℃氣浴恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束取3 mL過濾后的培養(yǎng)液于50 mL 容量瓶中，加入17 mL 超純水、3 mL 次氯酸鈉、20 mL苯酚鈉，混勻后靜置20 min顯色，定容。使用紫外分光光度計于578 nm 處測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算脲酶活性。脲酶活性用1 mL發(fā)酵液24 h降解尿素生成銨態(tài)氮的量表示。

1.2.5.4 16S rDNA分析

DNA 的提取與PCR 擴增：使用FastDNA?Spin Kit for Soil DNA提取試劑盒，完成DNA提取。PCR擴增區(qū)域為338F_806R，引物對應16S rDNA 的V3～V4區(qū)，上游引物338F：3'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5'，下游引物806R：3'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5'。完成預試驗后，PCR 正式試驗采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系。每個樣本3個PCR重復，將3個重復的PCR產物混合；使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。使用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒回收PCR 產物，將PCR 產物用Quantus?Fluorometer 進行檢測定量。按照每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合。

構建Miseq 文庫與測序：使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴增進行文庫模板的富集；④磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序。按照平臺說明進行操作：①DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；②另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋”；③擴增，產生DNA 簇；④DNA 擴增子線性化成為單鏈；⑤加入改造過的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；⑥用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；⑦將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3′端黏性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；⑧統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA 片段的序列。使用FLASH 軟件對測序序列進行拼接，同時使用fastp 軟件進行質量控制，隨后使用UPARSE 軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類。

生物多樣性分析：將相似性大于97%的序列定義為一個OTU，每個OTU 對應不同的微生物物種。對16個樣本在OTU分類水平進行PCA分析以及相關性分析。同時對各組樣本的有效序列分別在門水平和屬水平上進行微生物群落分析。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Origin 9.0軟件中的“ANOVA andt-test”進行差異顯著性分析，以P＜0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同處理對蛋雞盲腸微生物體外發(fā)酵氨氣產量的影響

由圖1 可知，CT 組的氨氣產量最高為（14.73±0.42）μg，顯著高于A、B、C組（P＜0.05）；C組的氨氣產量最低為（10.84±0.11）μg，顯著低于另外3組（P＜0.05）；A組氨氣產量大于B組，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵氨氣產量的影響

2.2 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵脲酶活性的影響

圖2 表明，CT 組的脲酶活性最高為（0.68±0.01）mg/mL·24 h，顯著高于A、B、C組（P＜0.05）；C組的脲酶活性最低為（0.45±0.03）mg/mL·24 h，顯著低于另外3 組（P＜0.05）；A 組與B 組間脲酶活性差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵脲酶活性的影響

2.3 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵尿素產量的影響

如圖3 所示，C 組發(fā)酵液中的尿素含量最高為（0.175±0.010）mmol/L，顯著高于其他3 組（P＜0.05）；CT、A組和B組間的差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵尿素含量的影響

2.4 不同處理對蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵液中微生物群落的影響

2.4.1 樣品信息統(tǒng)計

如表2所示，本試驗共獲取575 267條有效序列，在檢測的16個樣本中共檢出822個微生物OTU，涵蓋16門、26綱、50目、90科、199屬、366種。

表2 樣本檢測信息統(tǒng)計

2.4.2 樣本OTU的主成分分析

由圖4可知，CT組與3個處理組均分開，3個處理組之間也互相分開沒有聚集，說明不同的添加處理改變了發(fā)酵液中的微生物組成。

圖4 不同處理蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵液的PCA分析

2.4.3 樣本的相關性分析

由圖5 可知，熱圖中各處理的聚類較為規(guī)律，CT組獨自聚類在一起，而C 組也聚類在一起，與OTU 的主成分分析的結果相同，反映了不同的添加處理會影響到發(fā)酵液的微生物組成。

圖5 不同處理蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵液的相關性熱圖

2.4.4 門（Phylum）分類水平上的細菌菌落分析

將所有樣本的有效序列在門分類水平進行細菌群落分析，組內樣本計算平均值。由圖6和表3可知，在A、B、C 組中，擬桿菌門是優(yōu)勢菌門，相對豐度分別為40.8%、39.3%及41.0%；A、C組的擬桿菌門豐度顯著大于B組（P＜0.05）；而CT組擬桿菌門相對豐度只有37.0%顯著低于A、B、C組（P＜0.05）。CT組的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門，相對豐度為39.1%，顯著大于A、B、C組（P＜0.05)，同時A組和B組在厚壁菌門的相對豐度上差異不顯著（P＞0.05)，C組的厚壁菌門相對豐度在所有分組中最低。

圖6 不同處理蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵液門水平上的細菌群落結構分析

表3 門水平主要細菌結構變化(%)

2.4.5 屬（Genus）分類水平上的細菌菌落分析

由表4和圖7可知，在屬分類水平上，4個組的優(yōu)勢菌屬都是擬桿菌屬，但A、B、C組的擬桿菌屬相對豐度均顯著大于CT 組（P＜0.05）；其中C 組的擬桿菌屬相對豐度為20.6%，顯著大于其他組（P＜0.05）。脫硫弧桿菌屬在CT組中的相對豐度最大為3.87%，顯著大于其他3 組（P＜0.05）。乳酸桿菌屬方面，C 組的相對豐度最大為4.24%，顯著大于其他3組（P＜0.05），CT組相對豐度最低（1.76%），顯著低于A、B組（P＜0.05）。

表4 屬水平主要細菌結構變化(%)

圖7 不同處理蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵液屬水平上的細菌群落結構分析

3討論

本試驗研究結果表明，添加0.15%丁酸鈉可減少氨氣釋放（P＜0.05），其原因可能為：在蛋雞體內的盲腸發(fā)酵階段，氨氣的產生途徑主要來自尿酸的降解或盲腸微生物的分解代謝[1]；其中盲腸中的尿酸是氨氣產生的主要底物[16]。尿酸降解包含了一系列的酶促反應，其中尿酸酶和脲酶是該過程的限速酶[17]。在蛋雞盲腸內容物體外發(fā)酵時添加丁酸鈉可以有效抑制尿酸酶與脲酶活性，限制尿酸降解，進而減少氨氣產生，王安平[1]的研究中有類似報道。

本試驗研究還發(fā)現(xiàn)，1.5%沸石的添加也可減少氨氣釋放（P＜0.05），羅一鳴等[12]有相似研究結果，他們發(fā)現(xiàn)在雞糞堆肥時添加沸石可以吸附固定氨態(tài)氮達到減少氨氣揮發(fā)的效果。除此以外，沸石具有比表面積大、吸附性能好、表面呈負電性、有利于絡合吸附重金屬離子等特性[18-19]；而脲酶的活化與催化均需要鎳離子的參與[20]，沸石可吸附固定鎳離子，進而有效抑制脲酶活性，減少氨氣的產生。

值得注意的是，相對于其他所有組，0.15%丁酸鈉和1.5%沸石的混合添加組在減少氨氣排放上效果最佳，與對照組（脲酶活性0.68 mg/mL·24 h）相比，混合添加處理組對脲酶活性的抑制率達到了33.82%?；诖?，推測丁酸鈉與沸石可能存在協(xié)同作用，與單一添加丁酸鈉或沸石相比，能進一步降低脲酶活性，抑制尿酸—尿素—氨氣的分解過程，減少氨氣產生。通過脲酶活性與尿素含量檢測結果表明，混合添加丁酸鈉和沸石可增強脲酶的抑制效果。而其協(xié)同作用發(fā)生的原因可能與沸石通過分子間作用力將正丁酸吸附到其表面[21]相類似，沸石吸附丁酸鈉進而使其表面的負電性增大，增強了對鎳離子的吸附作用，使鎳離子絡合固化增多而進一步抑制了脲酶活性。

本研究中樣本的主成分分析（圖4）與相關性分析（圖5）的結果均表明，三種不同的添加處理均可以影響體外發(fā)酵體系的微生物群落結構。王安平[1]有相似的探究結果，其研究發(fā)現(xiàn)在蛋雞盲腸內容物發(fā)酵時，微生物組成會隨丁酸鈉添加量的改變而變化。另外有研究表明，在日糧中添加沸石對肉雞盲腸微生物結構有一定影響[22]。上述研究與本研究結果基本相符。在3個添加處理組的發(fā)酵液樣品中，擬桿菌門與擬桿菌屬是優(yōu)勢菌。Zocco等[23]研究指出，擬桿菌屬以碳水化合物作為主要的能量來源，對氨基酸的分解利用較少，因此產氨較少。有研究中提到丁酸鈉可提高部分碳水化合物發(fā)酵菌的相對豐度，丁酸鈉干預后產氨能力弱的菌屬相對豐度增加，產氨能力強的菌屬相對豐度下降[1]。

強產氨菌屬相對豐度的下降可能是自身合成的脲酶活性被抑制，無法分解產生氨氣來維持其生存環(huán)境平穩(wěn)所致。Ricci等[24]曾報道過幽門螺旋桿菌分解代謝產生氨氣并利用其提高腸道pH 來存活。Kuever 等[25]報道脫硫弧桿菌屬在代謝時可以將硝酸鹽還原成氨。本研究結果表明，脫硫弧桿菌相對豐度隨著添加處理的不同而改變，其中混合添加組的相對豐度最低。很可能是因為混合添加組對脲酶活性存在更強的抑制作用，最終導致其相對豐度下降。這與上述的研究推測相符。當大部分產氨的有害菌增殖被抑制后，部分有益菌的相對豐度會出現(xiàn)上升。周巖民等[26]研究證明了不同粒度的沸石均有降低肉雞空腸中大腸桿菌數(shù)、提高乳酸桿菌數(shù)的效果。而郭傳珍等[27]也曾報道了飼糧中混合100 g/t的丁酸鈉，在肉雞42日齡時可以顯著提高乳酸桿菌數(shù)量，抑制大腸桿菌的繁殖。本研究結果與上述研究基本相符，并且混合添加組對乳酸桿菌屬的提高效果最好，側面表明混合添加組對產氨有害菌的抑制效果更強，且其原因也極有可能是丁酸鈉與沸石之間發(fā)生協(xié)同作用，使沸石表面對鎳離子等的吸附作用增強，進而抑制脲酶活性所致。當然，對于其是否如此，需要進一步對丁酸鈉與沸石做電鏡觀察研究。

4 結論

本研究通過體外發(fā)酵試驗對混合添加丁酸鈉與沸石減氨排放的可行性進行了驗證。試驗結果表明，在體外發(fā)酵體系內混合添加丁酸鈉和沸石可以顯著抑制脲酶活性進而顯著減少氨氣產生，丁酸鈉與沸石在抑制脲酶活性減少氨排放上可能存在協(xié)同作用。此外混合添加處理還對發(fā)酵體系中的微生物群落結構造成影響，產氨的脫硫弧桿菌屬的增殖被抑制，而以擬桿菌屬為主的碳水化合物發(fā)酵菌相對豐度上升成為優(yōu)勢菌屬；乳酸桿菌屬的相對豐度也有明顯上升。