轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物鑒定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建與應(yīng)用

王 顥 潛 ， 黃 炎 ， 石 雨 婷 ， 朱 鵬 宇 ， 謝 宇 宙 ， 黃 春 蒙 ， 盧 小 雨 ，付偉

1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；

2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；

3.北京衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，北京 101149；

4.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)，北京 100048；

5.三亞中國(guó)檢科院生物安全中心，海南 三亞 572025；

6.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518038

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）基因是常見(jiàn)的抗蟲(chóng)基因，存在于絕大多數(shù)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物中。自Bt抗蟲(chóng)基因被發(fā)現(xiàn)后，轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)作物發(fā)展迅速，其中轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉、抗蟲(chóng)大豆、抗蟲(chóng)玉米等轉(zhuǎn)基因作物對(duì)抵抗害蟲(chóng)起到了巨大作用［1-2］。然而，隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用步伐的加快，轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管任務(wù)面臨著更大挑戰(zhàn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作也提出了更高的要求。監(jiān)管檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的第一步就是對(duì)樣品進(jìn)行篩查，判斷有無(wú)轉(zhuǎn)基因成分。標(biāo)準(zhǔn)樣品作為實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)支撐檢測(cè)工作的開(kāi)展，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性、有效性和可溯源性具有重要意義。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺失將嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)、身份驗(yàn)證、國(guó)內(nèi)監(jiān)管、進(jìn)出口檢驗(yàn)、企業(yè)自控和國(guó)際貿(mào)易互認(rèn)等工作。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建方面的相關(guān)研究非?；钴S，已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子覆蓋了多數(shù)大規(guī)模商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物［3］。質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)樣品由一種含有外源基因片段和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段的質(zhì)粒分子制備而成［4］。與傳統(tǒng)的基體標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子通過(guò)微生物進(jìn)行存儲(chǔ)和大量培養(yǎng)，不依賴原材料，質(zhì)粒DNA容易提取且純度較高，可有效地解決陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品匱乏和制備困難的問(wèn)題，給檢測(cè)工作帶來(lái)便利，因此，也常被科研工作者研制成轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品［5］。自2008年國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)成立以來(lái)，我國(guó)作為轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)和應(yīng)用的大國(guó)，也正式啟動(dòng)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品研究工作，發(fā)布了關(guān)于基體標(biāo)準(zhǔn)樣品候選物鑒定方法以及制備技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，初步建立了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)，并開(kāi)展了質(zhì)粒和基體標(biāo)準(zhǔn)樣品定值技術(shù)方面的研究［6-8］。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制出針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、馬鈴薯、水稻等多種作物檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)樣品/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［9-11］。

我國(guó)海關(guān)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)口的相關(guān)法規(guī)較為嚴(yán)格，面對(duì)已經(jīng)占據(jù)世界轉(zhuǎn)基因作物市場(chǎng)且日益增加的轉(zhuǎn)Bt基因作物，我國(guó)海關(guān)急需精確、簡(jiǎn)便的Bt基因檢測(cè)手段，以便進(jìn)一步加強(qiáng)我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)Bt作物的監(jiān)管。目前國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的針對(duì)Bt基因進(jìn)行檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子主要是Cry1Ab和Cry1Ac基因，這2個(gè)基因無(wú)法對(duì)現(xiàn)階段常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行覆蓋。因此，開(kāi)發(fā)覆蓋Bt基因更多的Bt陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子對(duì)于轉(zhuǎn)Bt基因植物的檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。

本研究為滿足境內(nèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管檢測(cè)以及跨境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的需求，針對(duì)3種Bt基因Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A檢測(cè)時(shí)所需要的陽(yáng)性對(duì)照需求，人工合成了3種Bt基因序列，將序列克隆到質(zhì)粒載體上，得到了可同時(shí)滿足定性檢測(cè)轉(zhuǎn)Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A3種轉(zhuǎn)基因外源基因成分的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子以及進(jìn)行適用性分析，確保了本研究中Bt基因陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中的Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A基因qPCR篩選元件特異性檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照需求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)、Genegenius凝膠成像分析儀、Eppendorf高速冷凍離心機(jī)、Eppendorf紫外分光光度計(jì)、電泳槽、超凈工作臺(tái)、-70 ℃超低溫冰箱、涂布棒、剪刀、玻璃棒、天平、量筒、移液槍和溫度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

LB培養(yǎng)基、瓊脂糖、100 mg·mL-1氨芐青霉素、LB液體培養(yǎng)基、10×T4 DNA ligase buffer，2×TaqMan universal master mix、EcoR V和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、QIAfilter plasmid midi kits質(zhì)粒提取試劑盒。

1.3 質(zhì)粒DNA分子的構(gòu)建和提取

本研究以海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中3種Bt基 因Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A作為構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的靶標(biāo)序列，將3種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的靶標(biāo)序列拼接到一起，長(zhǎng)328 bp，采用基因合成技術(shù)人工合成目的序列，然后將pUC57質(zhì)粒用平端酶EcoR V酶切，通過(guò)平端連接克隆，構(gòu)建了陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，最后將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，便于保存與擴(kuò)繁質(zhì)粒DNA。

1.4 陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的驗(yàn)證

1.4.1質(zhì)粒DNA純度與濃度測(cè)定 通過(guò)紫外分光光度法（Nanodrop 2000）測(cè)定pUC57-Cry質(zhì)粒DNA的A260/A280值。實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA的A260/A280應(yīng)為1.8～2.0，A260/A230為2.0～2.3。

1.4.2酶切驗(yàn)證 取1 μL質(zhì)粒DNA樣品，采用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒，酶切體系為：HindⅢ酶2 μL，酶切緩沖液2 μL，質(zhì)粒DNA 14 μL，去離子水補(bǔ)足20 μL。37 ℃下水浴3 h后用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)條帶大小對(duì)質(zhì)粒片段加以驗(yàn)證。

1.4.3測(cè)序驗(yàn)證 將構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，搖菌培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒交擎科生物有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果采用EBI軟件進(jìn)行比對(duì)分析，驗(yàn)證序列的正確性。

1.4.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增功能驗(yàn)證 按照《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）對(duì)3種外源元件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增已驗(yàn)證質(zhì)粒的可用性。擴(kuò)增體系為：50 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 min，60 ℃退火延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；在退火延伸階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集。檢測(cè)體系為：2×TaqMan Universal Master Mix 10 μL， 上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探針（10 μmol·L-1，0.5 μL）質(zhì)粒DNA模板2 μL，ddH20補(bǔ)足至20 μL，3種外源元件的引物探針如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR篩查體系Table 1 Real-time fluorescent PCR screening system

1.5 陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子適用性測(cè)試

1.5.1陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子Bt基因擴(kuò)增效率測(cè)試與適宜稀釋濃度分析 本研究用去離子水將質(zhì)粒原液稀釋成8個(gè)濃度梯度（100倍～107倍），分別繪制3個(gè)Bt基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）對(duì)3個(gè)目標(biāo)Bt基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值間的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制3個(gè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)試其擴(kuò)增效率。同時(shí)根據(jù)不同稀釋濃度的qPCR擴(kuò)增Ct值確定質(zhì)粒合適的稀釋倍數(shù)，將質(zhì)粒用去離子水稀釋。

1.5.2陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用測(cè)試 為了測(cè)試Bt陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用效果，本研究選取了轉(zhuǎn)Bt基因玉米MON810（Cry1Ab）、DBT418（Cry1Ac）、MIR604（Cry3A）、轉(zhuǎn)基因玉米品系MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A基因）以及送檢的未知玉米樣品作為研究材料，并依據(jù)海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）對(duì)不同樣品分別進(jìn)行3個(gè)目標(biāo)Bt基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。采用天根植物基因組提取試劑盒提取了轉(zhuǎn)Bt基因玉米與經(jīng)檢測(cè)鑒定的未轉(zhuǎn)入Bt基因的非轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA，作為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照模板，選用本研究制備的質(zhì)粒樣品作為陽(yáng)性對(duì)照模板，然后按照海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中的qPCR程序以及相應(yīng)的引物探針，對(duì)1組質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照、3組轉(zhuǎn)Bt基因玉米基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照、1組MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A基因）陰性對(duì)照和1組未知樣品進(jìn)行針對(duì)3個(gè)Bt基因靶標(biāo)的熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。檢測(cè)體系同1.4.4，3種外源元件的引物探針如表2所示。

表2 3種Bt基因引物和探針序列Table 2 Three Bt gene primers and probe sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建與驗(yàn)證

將長(zhǎng)約328 bp的靶標(biāo)序列克隆到pUC57質(zhì)粒上，命名為pUC57-Cry。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，使用氨芐青霉素篩選出陽(yáng)性克隆，并通過(guò)菌液的培養(yǎng)得到了大量純化質(zhì)粒。

2.1.1質(zhì)粒DNA純度與濃度測(cè)定結(jié)果 利用紫外分光光度法（Nanodrop2000）測(cè)定pUC57-Cry質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的A260/A280值為1.88 ± 0.01，介于1.8～2.0，A260/A230值大于2.0，濃度為76.1 ± 0.2 ng·μL-1，表明樣品純度符合要求，利用QIAfilter plasmid midi kits試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，能夠滿足大批量制備陽(yáng)性質(zhì)粒樣品。

2.1.2酶切驗(yàn)證結(jié)果 酶切結(jié)果如圖1所示，通過(guò)Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切獲得了與預(yù)期序列大小一致的單一條帶（約3 000 bp），條帶清晰明亮，且無(wú)雜帶和RNA條帶，說(shuō)明提取的質(zhì)粒DNA質(zhì)量高。

圖1 pUC57-Cry質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig. 1 The results of molecular digestion of pUC57-Cry plasmid

2.1.3測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 測(cè)序所得序列與構(gòu)建的序列采用EBI軟件比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，序列的匹配率為100%，進(jìn)一步驗(yàn)證了質(zhì)粒載體中目的序列的正確性。

圖2 測(cè)序序列與目的序列比對(duì)圖Fig. 2 EBI software compares the sequencing sequence with the target sequence diagram

2.1.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增功能驗(yàn)證結(jié)果 3種Bt基因Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A特異性序列qPCR擴(kuò)增均產(chǎn)生典型擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增Ct值如表3所示，結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明構(gòu)建的pUC57-Cry質(zhì)粒具有預(yù)期擴(kuò)增功能，能滿足出入境海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）熒光PCR擴(kuò)增要求。

表3 pUC57-Cry質(zhì)粒3種外源基因qPCR擴(kuò)增Ct值Table 3 The Ct values of the three exogenous genes of pUC57-Cry plasmids amplified by qPCR

2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒分子適用性測(cè)試結(jié)果

2.2.1陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子Bt基因擴(kuò)增效率測(cè)試與適宜稀釋濃度分析結(jié)果 如圖3所示，以梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)線性系數(shù)均在0.99以上，線性系數(shù)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率在-3.1～-3.6之間，即擴(kuò)增效率在90%～110%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)均在可接受范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效率的要求。擴(kuò)增效率測(cè)試結(jié)果表明，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子作為海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中要求的陽(yáng)性對(duì)照，采用標(biāo)準(zhǔn)中的實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)方法能正常擴(kuò)增，本研究制備的質(zhì)粒樣品適合用作轉(zhuǎn)Bt基因產(chǎn)品成分檢測(cè)鑒定的實(shí)時(shí)熒光PCR陽(yáng)性對(duì)照。

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒靶基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Amplification standard curve of positive plasmid target gene

梯度稀釋后的qPCR擴(kuò)增Ct值結(jié)果顯示，除106倍和107倍稀釋外，其余各個(gè)稀釋梯度3個(gè)基因的擴(kuò)增Ct值均小于35，符合海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照熒光PCRCt值的要求（小于35）。為了穩(wěn)定保存標(biāo)準(zhǔn)樣品，本研究將質(zhì)粒用去離子水稀釋100倍（Ct值20左右）?；诒狙芯康尿?yàn)證結(jié)果，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)中研制的的標(biāo)準(zhǔn)樣品在稀釋100～1 000倍后，仍可以作為檢測(cè)Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A3種外源基因的陽(yáng)性對(duì)照使用。

2.2.2陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用測(cè)試 熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示（表4），轉(zhuǎn)Bt基因玉米MON810（Cry1Ab）、DBT418（Cry1Ac）、MIR604（Cry3A）與陽(yáng)性質(zhì)粒分子的3個(gè)靶標(biāo)均出現(xiàn)了典型的擴(kuò)增曲線，而送檢的未知玉米樣品與轉(zhuǎn)基因玉米品系MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A基因）中3種靶標(biāo)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，根據(jù)海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中的要求，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明送檢的未知玉米樣品不含有3種Bt基因?；蚪M陽(yáng)性對(duì)照與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果說(shuō)明，pUC57-Cry質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照可以替代相應(yīng)基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)減少了基因組的提取步驟，操作更加簡(jiǎn)便。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)時(shí)熒光PCR成分定性檢測(cè)應(yīng)用測(cè)試結(jié)果表明，海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）可用pUC57-Cry質(zhì)粒分子作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品是否含有Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A基因成分時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照。本研究制備的pUC57-Cry陽(yáng)性質(zhì)粒適用于轉(zhuǎn)Cry1Ab、Cry1Ac與Cry3A基因產(chǎn)品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定檢測(cè)的質(zhì)控樣品。

3 討論

現(xiàn)階段，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用的標(biāo)準(zhǔn)品樣品主要有3種形式：基體標(biāo)準(zhǔn)樣品、基因組標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中基體標(biāo)準(zhǔn)樣品為直接通過(guò)研磨植物種子或葉片制備而成的標(biāo)準(zhǔn)樣品，不僅可以對(duì)PCR流程提供陽(yáng)性質(zhì)控，同時(shí)也可以對(duì)樣品的核酸提取部分提供質(zhì)控，是適用性最強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品類(lèi)型。但是，目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制方主要為IRMM、AOCS等國(guó)際組織，使用成本高，樣品獲取困難，通常從訂購(gòu)到實(shí)驗(yàn)需要半年以上時(shí)間，這極大地限制了基體標(biāo)準(zhǔn)樣品在實(shí)際工作中的應(yīng)用［12-14］?；蚪M標(biāo)準(zhǔn)樣品通過(guò)陽(yáng)性粉末提取基因組而來(lái)，在使用階段雖然不能質(zhì)控核酸的提取步驟，但是使用簡(jiǎn)單，無(wú)需提取可直接作為陽(yáng)性對(duì)照添加，靶標(biāo)質(zhì)控范圍廣，可以涵蓋轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的各個(gè)靶標(biāo)。但是由于核酸的不穩(wěn)定性，這一類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)運(yùn)輸條件以及核酸濃度的要求極為苛刻，容易受到運(yùn)輸以及儲(chǔ)存過(guò)程中的影響而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)樣品失效。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品是3種標(biāo)準(zhǔn)樣品中制備最為靈活、最不受轉(zhuǎn)基因樣品影響的標(biāo)準(zhǔn)樣品種類(lèi)，由于其產(chǎn)品性質(zhì)簡(jiǎn)單，且在分子生物學(xué)層面上可操作性較強(qiáng)，可以通過(guò)重組插入多種外源序列，因此，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品已經(jīng)逐漸成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要組成部分［14-18］。近年來(lái)，針對(duì)轉(zhuǎn)基因品系的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不斷問(wèn)世，通過(guò)完善的特性值驗(yàn)證、均勻性和穩(wěn)定性驗(yàn)證，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品也可以在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)端發(fā)揮巨大作用［19］。

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的基石，目前，在境內(nèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)測(cè)以及口岸跨境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)中［20］，海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）具有廣泛的應(yīng)用范圍。Bt基因是轉(zhuǎn)基因作物中常見(jiàn)的外源功能基因，由于Bt序列的可變性較強(qiáng)，Bt基因檢測(cè)中的陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，配套開(kāi)發(fā)可以滿足該標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)Bt基因組合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)于進(jìn)一步完善轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化體系具有重要意義。

本研究在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)實(shí)際需求的基礎(chǔ)上，以海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中3種Bt抗蟲(chóng)基因作為靶序列，克隆到載體而得到了含有3種Bt基因的質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)粒驗(yàn)證與適用性測(cè)試，結(jié)果表明本研究制備的pUC57-Cry陽(yáng)性質(zhì)粒滿足海關(guān)技術(shù)規(guī)范《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》（SN/T1204—2016）中的相關(guān)檢測(cè)要求，能夠替代相應(yīng)的基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照而作為轉(zhuǎn)Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A基因產(chǎn)品基因特異性qPCR定性檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。