香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2細胞活性研究

王士博 ， 劉金娟

江蘇師范大學生命科學學院，江蘇 徐州 221116

香蕉（Musa sapientum）是熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物，內(nèi)部果肉為主要的食用部位。2020年，世界香蕉總產(chǎn)量為119.83×109kg，我國香蕉總產(chǎn)量為11.87×109kg，并且呈逐年上升趨勢，我國已成為世界第二大香蕉生產(chǎn)國［1］。香蕉皮大約占果實重量的30%左右，大量香蕉皮的廢棄不僅造成資源浪費，還會引起環(huán)境污染。研究表明，香蕉皮中含有豐富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪和糖類、維生素、多酚類等物質(zhì)［2］，具有抗高血壓、抗癌、抗菌、抗氧化等活性［3-4］。香蕉皮中總黃酮對羥自由基、ABTS+自由基均有一定的清除能力及Fe3+還原能力［5］。Rebello等［6］發(fā)現(xiàn)香蕉皮粉因其總酚含量高而具有高抗氧化性。Akamine等［7］發(fā)現(xiàn)香蕉皮甲醇提取物對睪酮治療小鼠前列腺增生有抑制作用。Fu等［8］從香蕉皮提取物中分離得到的新化合物XJP-1能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的單核細胞內(nèi)皮粘附。熊燕飛等［9］發(fā)現(xiàn)香蕉皮粗多糖可明顯抑制體內(nèi)實體瘤生長，體外對Hela細胞和前列腺癌PC-3M細胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，且隨時間的延長，凋亡率增加。目前，國內(nèi)對于香蕉皮的研究主要集中于多糖、多酚等物質(zhì)的提取方法和工藝，對其功能及深加工方面的研究相對不足。關(guān)于香蕉皮提取物在抗癌和抗氧化活性方面的研究少有系統(tǒng)報道。充分發(fā)揮香蕉皮的資源優(yōu)勢，對其進行高值化開發(fā)利用，不僅可以減少對環(huán)境的污染，同時也能產(chǎn)生極大的經(jīng)濟價值和社會效益。因此，本文初步測定了香蕉皮提取物（banana peel extraction，BPE）中總黃酮和總多酚的含量，探究了BPE對DPPH和O2-自由基的清除能力以及對HepG2細胞增殖的抑制作用，以期為進一步綜合利用香蕉皮提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

香蕉購自本地大型超市，正常成熟度，表面洗凈晾干水分，取皮后用家用榨汁機取汁，12 000 r·min-1，4 ℃離心取上清，過濾除菌后-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

Alamar Blue購自美國Sigma公司；Caspase-9、Caspase-3抗體購自美國Santa cruz公司；Bad、Bid、Bak、Apaf-1、Bax、Bcl-X、Bcl-2、p53和GAPDH抗體購自美國Bioworld公司；細胞裂解液、Caspase-9和Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；PARP抗體和Caspase-3抑制劑Ac-DEVDCHO購自碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-9抑制劑Z-LEHD-FMK購自Biovision公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 供試細胞株

人肝癌細胞HepG2購于上海中科院細胞庫，由本實驗室復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。

1.3 儀器與設(shè)備

IBE2000顯微鏡購自COIC公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司；微孔板檢測儀購自Bio-Teck公司；96孔細胞培養(yǎng)板購自美國NEST公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1總多酚和總黃酮含量的測定 采用福林酚法和硝酸鋁比色法分別檢測總酚和黃酮含量［10］。提取物中總酚和總黃酮的含量以每升BEP中沒食子酸和蘆丁當量表示。制作沒食子酸（0～200 μg·mL-1）標準曲線，按公式（1）計算BPE中總酚的含量：

其中y為吸收值；x為沒食子酸濃度。

制作蘆丁（0～64 μg·mL-1）標準曲線，按公式（2）計算BPE中總黃酮的含量：

其中y為吸收值；x為蘆丁的濃度。

1.4.2DPPH自由基清除測定 參照鐘丘實等［11］測定方法，本研究使用的BPE為原液。

1.4.3超氧陰離子自由基清除測定 采用鄰苯三酚自氧化法，參照佀鳳為等［12］的方法，使用BPE原液進行測定。

1.4.4細胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤活性實驗 采用Alamar Blue法檢測BPE體外抗腫瘤活性，具體實驗方法參照Liu等［13］的方法。

1.4.5Hoechst 33258染色 取形態(tài)均勻狀態(tài)良好的HepG2細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，加入BPE培養(yǎng)48 h后，用倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)并拍照；細胞收集后，加入Hoechst33258染液（終濃度5 μg·mL-1），染色10 min，熒光顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

1.4.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 實驗步驟參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書。

1.4.7活性氧檢測 按照試劑盒的說明書進行操作，10 μmol·L-1DCFH-DA染液37℃孵育20 min。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，熒光顯微鏡觀察。

1.4.8Western blot實驗 BPE處理HepG2細胞48 h后提取蛋白，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后加入一抗過夜，二抗37 ℃孵育2 h，化學發(fā)光顯色拍照。

1.4.9Caspase酶活性的檢測 按照酶活性檢測試劑盒說明書進行Caspase酶活性測定。

1.4.10抑制劑對BPE抗腫瘤活性的影響 HepG2細胞接種96孔板，貼壁后加入10 μmol·L-1Z-LEHD-FMK或20 μmol·L-1Ac-DEVD-CHO，孵育2 h后加入BPE繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測細胞活性。

1.4.11數(shù)據(jù)分析 每個實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標準偏差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，P＜0.05表示統(tǒng)計學上有差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPE中總黃酮和總多酚含量

使用福林酚法檢測BPE中總酚含量，結(jié)果為39.23±2.35 mg·L-1；采用硝酸鋁比色法檢測總黃酮量，結(jié)果為26.53±1.97 mg·L-1。

2.2 BPE自由基清除能力

通過研究BPE對DPPH·和O2-·的清除率評估其抗氧化活性，結(jié)果顯示BPE對DPPH和O2-自由基的清除率分別為65.31%±3.82%和51.29%±4.23%。

2.3 BPE對HepG2細胞增殖活性的影響

不同濃度（0～100 mL·L-1）BPE處理HepG2細胞48 h后，Alamar Blue檢測結(jié)果顯示（圖1），與對照組相比，隨著BPE濃度的增加，HepG2細胞的活性逐漸降低，說明BPE對HepG2細胞增殖活性的抑制具有一定濃度依賴性。當BPE處理濃度為80 mL·L-1和100 mL·L-1時，HepG2細胞的活性分別為24%±4.37%和0.73%±0.06%，經(jīng)計算得到IC50為54.32±2.51 mL·L-1。IC50作為進一步研究BPE抑制HepG2細胞增殖分子機制的濃度選擇。

2.4 BPE對HepG2細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察顯示（圖2），與對照組相比，BPE（IC50）處理組HepG2細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，發(fā)生皺縮且有少量細胞漂浮。熒光顯微鏡觀察顯示，經(jīng)hoechst33258染色后，對照組細胞呈現(xiàn)均勻的藍色熒光，BPE處理的細胞顯示染色質(zhì)聚集和明亮的熒光，該結(jié)果提示BPE可誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡。

圖 1 BPE對HepG2細胞活力的影響Fig. 1 The effect of BPE on cell viability of HepG2 cells

圖2 BPE對HepG2細胞形態(tài)的影響 (40×)Fig. 2 Mophology of HepG2 cells treated with BPE (40×)

2.5 BPE對HepG2細胞凋亡的影響

為進一步驗證hoechst33258染色的結(jié)果，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，BPE處理組細胞凋亡率為22.21%±2.36%（P＜0.05，與對照組相比）（圖3），說明BPE確實可引起細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性。

圖3 流式細胞術(shù)檢測BPE對HepG2細胞凋亡的影響Fig. 3 Effect of BPE on cell apoptosis of HepG2 by flow cytometry

2.6 BPE對HepG2細胞中ROS水平的影響

研究表明，ROS在體內(nèi)的大量堆積會引起細胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細胞膜發(fā)生過氧化，增加膜通透性，降低細胞內(nèi)抗氧化酶活性，損傷蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)，最終誘導(dǎo)細胞加速凋亡［14］。如圖4所示，與對照組相比，BPE處理組中綠色熒光信號明顯增強，這說明BPE能夠明顯提高HepG2細胞的ROS水平。

圖4 BPE對HepG2細胞中ROS水平的影響Fig. 4 Effect of BPE on the ROS level in HepG2 cells

2.7 BPE對HepG2細胞內(nèi)凋亡蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示（圖5），與對照組相比，BPE處理組中促凋亡蛋白Bax、Bid、Bak、p53的表達水平提高，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達水平降低。PARP、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9在處理組中的表達水平也明顯升高。有研究表明，Caspase-9的激活、Bax、Bad和Bak的線粒體易位、MMP的去極化與隨后細胞色素c的釋放密切相關(guān)，后者與Apaf-1、ATP和Caspase-9結(jié)合，產(chǎn)生凋亡小體激活的Caspase-3，隨后PARP裂解，一旦特異性底物PARP被切斷，就會誘導(dǎo)細胞凋亡［15］。

圖5 BPE處理48 h后對HepG2細胞中凋亡相關(guān)因子蛋白表達的影響Fig. 5 The expression of apoptosis-related factors in HepG2 cells treated with BPE for 48 h

2.8 BPE對HepG2細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響

為了進一步證實Caspase被激活，酶活性試劑盒檢測結(jié)果表明（圖6），BPE能夠顯著增加HepG2細胞中Caspase-3和Caspase-9的活性，進一步驗證了Western blot的結(jié)果。

圖6 BPE對HepG2細胞中Caspase活性的影響Fig. 6 Effect of BPE on Caspase enzyme activity in HepG2 cells

2.9 Caspase抑制劑對BPE促凋亡的影響

本研究利用Caspase-9和Caspase-3抑制劑（ZLEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO）來評估Caspase-9和Caspase-3在BPE誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用。結(jié)果如圖7所示，采用Z-LEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO預(yù)培養(yǎng)在一定程度上可顯著逆轉(zhuǎn)mActD對HepG2細胞的促凋亡作用，進一步證實BPE通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑誘導(dǎo)了HepG2細胞凋亡。

圖7 抑制劑對BPE促HepG2細胞凋亡的影響Fig. 7 Effect of inhibitor on the proliferation of BPE in HepG2 cells

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)多酚和黃酮廣泛存在于各種植物果皮中，具有較強的清除自由基和抗氧化活性，有助于延緩衰老、預(yù)防癌癥及抗炎癥等［15］。不同植物果皮中酚類和黃酮類的生物學活性受結(jié)構(gòu)和種類的影響，會顯示出不同的抗氧化活性［16-17］。鱷梨果皮中含有大量的多酚和黃酮類等物質(zhì)，對DPPH自由基具有明顯的清除能力［18］。利用超聲輔助法提取香蕉皮中的多酚，發(fā)現(xiàn)對花生油有較強的抗氧化效果［19］。采用有機溶劑浸提法提取香蕉皮中的總黃酮，在一定范圍內(nèi)對羥基自由基的清除率優(yōu)于同條件的維生素C［20］。本研究結(jié)果與上述文獻的結(jié)果一致，證明香蕉皮提取物中具有一定量的總多酚和總黃酮，進一步的自由基清除實驗證實了BPE的體外抗氧化清除能力，這為香蕉皮抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

研究發(fā)現(xiàn)，果皮提取物在癌癥治療和預(yù)防方面具有明顯的作用［21］。例如，柑橘皮中的黃酮在預(yù)防癌癥發(fā)生中發(fā)揮功能［22］；石榴皮提取物具有明顯的抗氧化活性以及對leukemia細胞的抗腫瘤和誘導(dǎo)凋亡活性［23］；富含多酚的山楂果皮提取物可誘導(dǎo)MCF-7細胞的凋亡［24］。與先前研究報道相一致，本研究在體外抗肝癌實驗中，香蕉皮提取物可有效地抑制人肝癌HepG2細胞的增殖活性，并且通過線粒體介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗肝癌細胞作用。但研究僅在體外探究了香蕉皮提取物作用于HepG2細胞的作用效果，未結(jié)合體內(nèi)實驗，因此，后續(xù)將對香蕉提取物作用動物的體內(nèi)實驗進行研究，以及在其他類型的腫瘤中探究其抗腫瘤活性。

綜上所述，香蕉皮提取物具有一定清除自由基的能力以及通過線粒體介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗肝癌作用，研究結(jié)果可為香蕉皮提取物用于抗氧化產(chǎn)品開發(fā)及肝癌預(yù)防提供了數(shù)據(jù)支持。