多基因甲基化檢測(cè)對(duì)宮頸癌及癌前病變篩查的價(jià)值

吳欣瑜，向 睿，吳雪輝，王靜依，孟 俠，李 薇，吳 垠

1)成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院婦產(chǎn)科 成都 610051 2)成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 成都 610051

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，因其較高的發(fā)病率和病死率，宮頸癌篩查備受臨床關(guān)注[1]。早期實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)篩查有利于宮頸惡性病變的盡早診斷和治療，是預(yù)防宮頸癌、降低宮頸癌病死率的關(guān)鍵。宮頸病變篩查方式中，巴氏細(xì)胞學(xué)檢測(cè)受限于樣本條件，易漏診；液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(thinprep cytologic test，TCT)可重復(fù)性差，診斷結(jié)果易受病理學(xué)醫(yī)師主觀影響，敏感度較低[2]；而高危型人乳頭狀瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)-DNA檢測(cè)則受HPV一過(guò)性感染的影響，特異度較低[3]。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)展，臨床發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生受表觀遺傳學(xué)影響，可通過(guò)檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的甲基化程度進(jìn)行篩查[4]。已有研究[5-6]顯示，多基因甲基化檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌、大腸癌等癌癥篩查中具有良好效能?；诖耍狙芯糠治霰容^了TCT、HR-HPV-DNA檢測(cè)、多基因甲基化檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變中的篩查效能，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象納入2019年1月至2021年6月于成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院行宮頸癌篩查的癌變高風(fēng)險(xiǎn)女性124例，年齡21～70(36.7±10.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有性生活。②就診時(shí)存在不同程度的陰道流血、陰道分泌物增多等癥狀。③年齡≥18歲。④能夠配合完成本研究所需進(jìn)行的相關(guān)檢測(cè)。⑤對(duì)研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有宮頸手術(shù)史。②有腫瘤病史或合并嚴(yán)重心腦血管疾病、系統(tǒng)性疾病等。③存在急性生殖道炎癥或其他婦科疾病史。④檢測(cè)前3 d有性生活或進(jìn)行陰道給藥、婦科檢查等操作。⑤檢查時(shí)處于月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期。

1.2 標(biāo)本采集①TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化檢測(cè)標(biāo)本：檢查醫(yī)師常規(guī)暴露患者宮頸并仔細(xì)清理宮頸口分泌物，通過(guò)在宮頸口旋轉(zhuǎn)專(zhuān)用采樣刷刷取脫落上皮細(xì)胞，于細(xì)胞保存液中保存細(xì)胞。②病理學(xué)檢測(cè)標(biāo)本：檢查醫(yī)師常規(guī)暴露患者宮頸并仔細(xì)清理宮頸口分泌物，在陰道鏡下觀察宮頸，對(duì)可疑部位多點(diǎn)取宮頸活檢組織，采集的組織固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中送檢。

1.3 TCT標(biāo)本經(jīng)病理科常規(guī)處理，由病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下讀片、診斷。參照國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)TBS分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，分為正常細(xì)胞或炎癥病變、未確定意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和腺癌，其中正常細(xì)胞或炎癥病變?cè)\斷為陰性，ASCUS及以上分級(jí)診斷為陽(yáng)性。

1.4 HR-HPV-DNA檢測(cè)與聯(lián)合診斷采用HC2 HR-HPV-DNA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)樣本/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的相對(duì)光單位結(jié)果進(jìn)行診斷，當(dāng)二者比值≥1.0即HR-HPV-DNA陽(yáng)性，反之即陰性。TCT聯(lián)合HR-HPV-DNA診斷為并聯(lián)診斷，即二者檢測(cè)結(jié)果中有任何項(xiàng)為陽(yáng)性即判定陽(yáng)性。

1.5 多基因甲基化檢測(cè)常規(guī)提取標(biāo)本DNA，檢驗(yàn)純度和濃度；DNA經(jīng)重亞硫酸氫鹽化學(xué)修飾，進(jìn)行6個(gè)獨(dú)立的甲基化特異性實(shí)時(shí)熒光PCR，選擇性擴(kuò)增甲基化的DNA區(qū)域，檢測(cè)儀器為美國(guó)Applied Biosystems 7000擴(kuò)增儀，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海杰諾生物科技有限公司。反應(yīng)條件如下：93 ℃ 2 min，93 ℃ 50 s、55 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。6個(gè)標(biāo)志物為ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671。ZNF671陽(yáng)性計(jì)0.5分，ASTN1、ITGA4、RXFP3、SOX17陽(yáng)性各計(jì)0.2分，DLX1陽(yáng)性計(jì)0.1分，綜合評(píng)分取各評(píng)分之和，≥0.5判斷為陽(yáng)性。

1.6 病理學(xué)檢測(cè)活檢組織標(biāo)本送至病理科，常規(guī)制片，制片時(shí)每張玻片上連續(xù)取片3～6片，由2名病理科醫(yī)師盲法閱片診斷。病理診斷[8]分為炎癥病變、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和SCC，其中炎癥病變?cè)\斷為陰性，其余分級(jí)診斷為陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化檢測(cè)的診斷效能以病理學(xué)結(jié)果(金標(biāo)準(zhǔn))為參照計(jì)算，通過(guò)Kappa值進(jìn)行組間一致性評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化檢測(cè)結(jié)果與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較病理學(xué)診斷，124例患者中陽(yáng)性86例(含CINⅠ 32例、CIN Ⅱ 25例、CIN Ⅲ 21例、SCC 8例)，陰性38例；TCT陽(yáng)性73例，陰性51例。病理學(xué)診斷中的6例炎癥病變者經(jīng)TCT診斷為ASCUS 5例和LSIL 1例，14例CIN Ⅰ和5例CIN Ⅱ 患者經(jīng)TCT診斷為正常細(xì)胞或炎癥病變。HR-HPV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性81例，陰性43例；病理學(xué)診斷中的8例炎癥病變者經(jīng)HR-HPV-DNA檢測(cè)診斷為陽(yáng)性，8例CIN Ⅰ和5例CIN Ⅱ 患者經(jīng)HR-HPV-DNA檢測(cè)診斷為陰性。多基因甲基化檢測(cè)陽(yáng)性85例，陰性39例；病理學(xué)診斷中的2例炎癥病變者經(jīng)多基因甲基化檢測(cè)診斷為陽(yáng)性，3例CIN Ⅰ者經(jīng)多基因甲基化檢測(cè)診斷為陰性。見(jiàn)表1。

表1 124例宮頸癌篩查癌變 高風(fēng)險(xiǎn)女性的TCT、HR-HPV-DNA、 多基因甲基化檢測(cè)結(jié)果與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 例

2.2 各檢測(cè)方法在宮頸癌篩查中的診斷效能宮頸癌及癌前病變篩查中，TCT、HR-HPV-DNA二者聯(lián)合檢測(cè)的效能優(yōu)于TCT或HR-HPV-DNA單項(xiàng)檢測(cè)效能；多基因甲基化檢測(cè)的診斷效能較TCT聯(lián)合HR-HPV-DNA檢測(cè)更優(yōu)，與病理學(xué)結(jié)果一致性高。見(jiàn)表2。

表2 TCT、HR-HPV-DNA、TCT聯(lián)合HR-HPV-DNA以及多基因甲基化檢測(cè)診斷宮頸癌的方法學(xué)評(píng)價(jià)

3 討論

女性機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)能夠識(shí)別并清除體內(nèi)入侵的HPV，這一相對(duì)短暫的感染過(guò)程即HPV一過(guò)性感染，這一情況下出現(xiàn)的感染并不會(huì)導(dǎo)致宮頸惡性病變，宮頸持續(xù)性的HR-HPV感染才是宮頸癌發(fā)病的主要原因，而一般從HPV感染發(fā)展為宮頸惡性病變需要超過(guò)10 a的時(shí)間[9]。因此女性定期進(jìn)行宮頸癌篩查具有重要意義，尤其是年輕女性的宮頸癌篩查不容忽視。

在宮頸癌篩查中，TCT經(jīng)高密度過(guò)濾膜可將采集標(biāo)本中的雜質(zhì)過(guò)濾分離，使得制片后宮頸上皮細(xì)胞能夠單層均勻分布，相較于傳統(tǒng)的直接取材涂片大大提高了診斷效能，但該方法仍受取樣準(zhǔn)確性、染色技術(shù)、病理科醫(yī)師閱片的主觀性等因素影響，假陰性較高[10]。本研究宮頸癌及癌前病變篩查中，TCT敏感度為77.91%，特異度為84.21%，均未達(dá)85%，Kappa值為0.567，與病理結(jié)果一致性?xún)H為中等，且敏感度偏低，即假陰性偏高。而大部分宮頸癌患者的病理樣本中均可檢出HPV，由此可通過(guò)HR-HPV-DNA檢測(cè)進(jìn)行宮頸癌篩查。但女性感染HPV后發(fā)展至宮頸癌需經(jīng)歷潛伏感染期、亞臨床感染期、臨床癥狀期和HPV相關(guān)腫瘤期多個(gè)階段，在各感染階段均可通過(guò)HR-HPV-DNA檢測(cè)技術(shù)檢出HPV，而處于潛伏感染期、亞臨床感染期的部分感染者并未出現(xiàn)癌性或癌前性的病理?yè)p害，這意味著HPV感染一過(guò)性會(huì)使這一檢測(cè)方法的特異度降低，影響宮頸癌篩查的準(zhǔn)確性[11]。本研究中，HR-HPV-DNA檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中的診斷敏感度為84.88%，特異度為78.95%，Kappa值為0.616，與病理結(jié)果一致性較高，但特異度偏低。為進(jìn)一步提高宮頸癌篩查的準(zhǔn)確性，臨床可聯(lián)合TCT結(jié)果與HR-HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌及癌前病變篩查中，TCT和HR-HPV-DNA聯(lián)合篩查敏感度和特異度分別為89.53%和89.47%，Kappa值為0.762，與病理結(jié)果一致性較高，提示聯(lián)合篩查可進(jìn)一步提高診斷效能，與既往研究[12]結(jié)果相符。其原因是TCT結(jié)果可彌補(bǔ)HR-HPV-DNA檢測(cè)在病理形態(tài)診斷方面的不足，而HR-HPV-DNA檢測(cè)又可為T(mén)CT結(jié)果補(bǔ)充HPV病毒活性的信息，二者互相取長(zhǎng)補(bǔ)短。

腫瘤通常由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的積累引起，檢測(cè)特定基因的表觀遺傳學(xué)變化可作為腫瘤篩查手段，而基因甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，現(xiàn)階段臨床研究較多[13]。宮頸組織中的基因甲基化分為宿主基因和HPV基因的甲基化兩類(lèi)，HPV基因甲基化可阻止其被機(jī)體免疫識(shí)別、清除而實(shí)現(xiàn)持久的感染狀態(tài)；宿主基因中的抑癌基因超甲基化會(huì)造成抑癌基因失活或轉(zhuǎn)錄遏制，原癌基因低甲基化會(huì)導(dǎo)致癌基因活化或再表達(dá)，兩種基因甲基化異常均會(huì)誘導(dǎo)癌變發(fā)生[14]。根據(jù)以上機(jī)制，臨床通過(guò)基因異常甲基化檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期診斷。目前關(guān)于宮頸癌基因甲基化的國(guó)內(nèi)研究多為單基因研究，雖然國(guó)外已有應(yīng)用多基因甲基化檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行宮頸癌篩查的報(bào)道，但由于國(guó)內(nèi)外宮頸癌的發(fā)病情況存在差異，多基因甲基化檢測(cè)在我國(guó)宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究選用的多基因甲基化檢測(cè)試劑盒涉及ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671，該試劑盒檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歐盟認(rèn)證，對(duì)宮頸癌具有較高敏感度和特異度。本研究結(jié)果顯示，多基因甲基化檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中的診斷敏感度、特異度分別為96.51%、94.73%，其診斷效能與國(guó)外研究[15]結(jié)果一致，均明顯高于TCT、HR-HPV-DNA檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)，提示多基因甲基化檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中具有極高的應(yīng)用價(jià)值。但值得注意的是，多基因甲基化檢測(cè)步驟較為繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高，在基層醫(yī)院中普及仍存在困難，可將其作為T(mén)CT、HR-HPV-DNA檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)外的輔助診斷方法，由此在減少漏診的同時(shí)避免不必要的活檢，減輕患者身體負(fù)擔(dān)。

綜上所述，多基因甲基化檢測(cè)用于宮頸癌及癌前病變?cè)\斷的效能較高，值得臨床推廣。