右美托咪定對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞LINC00982表達(dá)及生物學(xué)行為的影響

奚高原，丁成智，孟 睿，周曉蕾，周俊輝，鐘 巍，孟憲慧

1)鄭州大學(xué)附屬胸科醫(yī)院麻醉科 鄭州 450008 2)鄭州大學(xué)附屬胸科醫(yī)院胸外科 鄭州 450008 3)鄭州大學(xué)附屬胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450008

以外科手術(shù)治療為基石的多模式治療方案可以延長(zhǎng)食管癌患者的生存時(shí)間，但術(shù)后多種因素可引起食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[1-2]。右美托咪定是一種α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，因具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛的屬性而被廣泛使用[3]。有研究[4-7]表明，右美托咪定可抑制多種癌癥如骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌等的進(jìn)展。有研究[8]發(fā)現(xiàn)右美托咪定可抑制食管癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。但右美托咪定調(diào)控食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚未完全闡明。有研究[9]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00982的表達(dá)水平降低。食管癌中LINC00982的表達(dá)和作用還不清楚。本研究探討了右美托咪定對(duì)食管癌細(xì)胞LINC00982表達(dá)及生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑右美托咪定購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；人食管癌Eca-109細(xì)胞由美國(guó)ATCC提供；Trizol試劑、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒與LnRcute LncRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；pcDNA、pcDNA-LINC00982、si-NC和si-LINC00982購(gòu)自上海吉瑪公司；Annexin V Alexa Fluor 488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人Bax、N-cadherin、E-cadherin、Bcl-2、GAPDH抗體及二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 右美托咪定對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和LINC00982表達(dá)的影響

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞，分別加入不同濃度(25、50、100 μg/L)的右美托咪定處理24 h[6]，作為右美托咪定低、中、高濃度組。以只培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞為對(duì)照組。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞于96孔板內(nèi)接種各組細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%?？瞻捉M只加培養(yǎng)基和CCK-8溶液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照每孔500個(gè)細(xì)胞于6孔板內(nèi)接種各組細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)14 d形成克隆團(tuán)后停止培養(yǎng)，PBS洗滌后用甲醇固定20 min，棄甲醇后加入結(jié)晶紫染色液染色15 min，拍照并觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組1×105個(gè)細(xì)胞，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2～3次；用100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V Alexa Fluor 488充分混勻，4 ℃避光孵育5 min后加入10 μL 20 mg/L PI和400 μL PBS充分混勻，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞于6孔板內(nèi)接種各組細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在鋪板前先在24孔板背面用筆畫線做標(biāo)記，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，用20 μL槍頭垂直于孔板背面的橫線畫線，以此時(shí)間點(diǎn)為起始時(shí)刻，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出拍照。應(yīng)用Image J軟件檢測(cè)細(xì)胞遷移面積并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(起始時(shí)刻劃痕面積-24 h后的劃痕面積)/起始時(shí)刻劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲的Transwell實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室中分別加入200 μL各組細(xì)胞(約1×105個(gè))，在下室中加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清600 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后小心拭去上室濾膜上的細(xì)胞，PBS洗滌后用40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色液染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，取均值。

侵襲實(shí)驗(yàn)：使用基質(zhì)膠稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃孵育4 h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測(cè)Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白 分別收集各組細(xì)胞，加入500 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min后4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，放入離心管，-20 ℃保存。用SDS-PAGE分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜后封閉2 h，加入Bax(按1∶800稀釋)、E-cadherin(按1∶1 000稀釋)、Bcl-2(按1∶800稀釋)、N-cadherin(按1∶1 000稀釋)與GAPDH(按1∶3 000稀釋)抗體，4 ℃孵育24 h，加二抗(按1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。曝光顯影后應(yīng)用Image J軟件分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8qRT-PCR檢測(cè)LINC00982表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板使用LnRcute LncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×InR LncRNA PreMix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板50 ng，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00982的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 過(guò)表達(dá)LINC00982對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響參照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書，將pcDNA和pcDNA-LINC00982分別轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，即pcDNA組和pcDNA-LINC00982組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，采用1.2.2～1.2.8的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白以及LINC00982的表達(dá)情況。

1.4 抑制LINC00982表達(dá)對(duì)右美托咪定處理的Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響參照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書將si-NC、si-LINC00982分別轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，24 h后加入100 μg/L右美托咪定再培養(yǎng)24 h，作為右美托咪定+si-NC組和右美托咪定+si-LINC00982組。收集各組細(xì)胞，采用1.2.2～1.2.7的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白以及LINC00982的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響見表1。與對(duì)照組比較，右美托咪定低、中、高濃度組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，劃痕愈合率降低。

表1 右美托咪定對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(n=3)

2.2 右美托咪定對(duì)Eca-109細(xì)胞Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響見表2。與對(duì)照組比較，右美托咪定低、中、高濃度組Bax、E-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)水平升高，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低。

表2 右美托咪定對(duì)Eca-109細(xì)胞Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響(n=3)

2.3 過(guò)表達(dá)LINC00982對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響見表3、4。與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00982組Eca-109細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，劃痕愈合率和Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低。

2.4 抑制LINC00982對(duì)右美托咪定處理的Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響見表5、6。與右美托咪定+si-NC組比較，右美托咪定+si-LINC00982組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多，劃痕愈合率和Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)水平升高。

表3 過(guò)表達(dá)LINC00982對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(n=3)

表4 過(guò)表達(dá)LINC00982對(duì)Eca-109細(xì)胞Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響(n=3)

表5 抑制LINC00982表達(dá)對(duì)右美托咪定處理的Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(n=3)

表6 抑制LINC00982表達(dá)對(duì)右美托咪定處理的Eca-109細(xì)胞 Bax、E-cadherin、Bcl-2、N-cadherin蛋白和LINC00982表達(dá)的影響(n=3)

3 討論

右美托咪定能夠通過(guò)降低miR-1307表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。右美托咪定還能抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，改善卵巢癌大鼠免疫功能，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]。右美托咪定通過(guò)抑制MAPK通路可在體內(nèi)外抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長(zhǎng)[6]。本研究結(jié)果顯示右美托咪定可抑制Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生時(shí)有極性的上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而影響遷移及侵襲，而E-cadherin和N-cadherin可通過(guò)拮抗促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力[10-11]。本研究結(jié)果顯示右美托咪定能夠降低Eca-109細(xì)胞劃痕愈合率、減少細(xì)胞遷移和侵襲，并下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)和上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)。以上結(jié)果提示右美托咪定可抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

LINC00982可作為抑癌因子在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。LINC00982的低表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[12]。上調(diào)LINC00982表達(dá)可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制腎癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。胃癌組織中LINC00982低表達(dá)，LINC00982可與轉(zhuǎn)錄因子HEY1結(jié)合，通過(guò)阻斷HEY1與CTSF啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)CTSF的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[14]。本研究結(jié)果顯示右美托咪定處理后Eca-109細(xì)胞中LINC00982的表達(dá)水平升高。過(guò)表達(dá)LINC00982可抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示右美托咪定可能通過(guò)上調(diào)LINC00982的表達(dá)而發(fā)揮抗食管癌發(fā)生發(fā)展的作用。研究[15]表明抑制LINC00982表達(dá)可促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)小鼠移植瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示在右美托咪定作用下抑制LINC00982表達(dá)后Eca-109細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加，劃痕愈合率升高，Bcl-2和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平升高，Bax和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平降低，提示右美托咪定可通過(guò)促進(jìn)LINC00982表達(dá)而抑制Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，右美托咪定可通過(guò)上調(diào)LINC00982的表達(dá)而抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。