食管軟、硬癌分類(lèi)和人工智能研究：臨床病理特征和嗜酸性粒細(xì)胞-TGF-β1-纖維組織增生互作關(guān)系

王立東，馬琳琳，徐瑞華，宋 昕，趙學(xué)科，尤 朵，雷玲玲，魏夢(mèng)霞，王 苒，胡景峰，孟超龍，李興嵩，周福有，高社干

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽(yáng) 455000 3)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 河南洛陽(yáng) 471003

食管癌是極具中國(guó)人特色的惡性腫瘤，中國(guó)人食管癌在發(fā)病危險(xiǎn)因素、遺傳易感性、流行特征、組織學(xué)發(fā)生模式、病理常見(jiàn)類(lèi)型、多階段演進(jìn)的分子機(jī)制和分子分型、高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的防控思路等方面與西方人群明顯不同[1-2]。例如，中國(guó)人食管癌組織學(xué)類(lèi)型97%以上為鱗狀細(xì)胞癌，食管腺癌僅占1.5%，與西方80%以上為腺癌的組織學(xué)特征明顯不同[3]。目前，病理診斷仍然是食管癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷樣本主要來(lái)自食管內(nèi)鏡活檢和食管癌根治術(shù)切除的標(biāo)本，因此又稱外科病理。隨著食管癌變多階段演進(jìn)分子機(jī)制研究的深入，許多中國(guó)人食管鱗狀細(xì)胞癌獨(dú)特的分子畸變被發(fā)現(xiàn)，這些畸變分子與臨床表型關(guān)聯(lián)緊密，并據(jù)此形成食管癌的分子分型和分類(lèi)[4-7]。但是由于食管癌變分子機(jī)制尚未闡明，因此目前缺乏公認(rèn)的食管癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，食管癌分子分型研究仍是以食管癌病理分類(lèi)和分型為基礎(chǔ)而開(kāi)展。綜上，食管癌各種分類(lèi)和分型的基礎(chǔ)是病理觀察結(jié)果。

軟硬癌一詞來(lái)自臨床外科醫(yī)師對(duì)食管腫瘤質(zhì)地的描述，越來(lái)越多的研究提示，癌間質(zhì)反應(yīng)性網(wǎng)狀纖維組織增生是導(dǎo)致腫瘤質(zhì)地不同的主要原因。食管軟硬癌研究為食管癌臨床分類(lèi)和防治提供了新的思路。本文針對(duì)食管軟硬癌分類(lèi)分型和人工智能(artificial intelligence，AI)技術(shù)應(yīng)用的現(xiàn)狀及前景進(jìn)行了深入思考和總結(jié)，綜述如下。

1 AI應(yīng)用于食管癌病理診斷的可行性

目前，根據(jù)組織類(lèi)型，食管癌可分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌等二十余種類(lèi)型；根據(jù)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)程度(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移(M)特點(diǎn)，形成病理TNM分期；將各種病理TNM分期進(jìn)行優(yōu)化組合，形成臨床5級(jí)分期，并在5級(jí)分期的基礎(chǔ)上，形成早、中和晚分期。特別需要指出的是，目前，我國(guó)采用的病理和臨床分期標(biāo)準(zhǔn)是美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)2016年頒布、2018年實(shí)施的第八版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，該版的制定基于全球六大洲、33家醫(yī)療中心、共計(jì)22 654例患者的完整臨床信息，其中來(lái)自亞洲的患者僅占19%[9]；并且該版仍未考慮早期血道轉(zhuǎn)移、腫瘤體積、分子分型等重要臨床分子病理信息。因此AJCC第八版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)是否適合中國(guó)人群尚需更多研究支持。

病理觀察和診斷很大程度上取決于病理醫(yī)師的閱片經(jīng)驗(yàn)、取材及閱片的數(shù)量。同一張HE染色的組織切片中存在完全不同的分化病灶，甚至不同病理類(lèi)型、不同浸潤(rùn)程度等現(xiàn)象非常常見(jiàn)，這就是組織異質(zhì)性。病理診斷多是基于2～3塊1 cm3大小的腫瘤組織、3～4塊腫瘤切緣組織和10～20枚清掃的淋巴結(jié)組織的閱片結(jié)果；而每一個(gè)石蠟組織塊最多可收取5～6 μm厚、5～10片連續(xù)切片，90%以上的深部組織無(wú)法獲?。贿@種取材和切片的有限性使得腫瘤病灶的真實(shí)情況很難得到客觀反映。同時(shí)臨床病理醫(yī)師的診斷水平也不一致。很顯然，獲取足夠多的病理檢材和提高病理醫(yī)師的診斷水平是提高食管癌病理診斷水平的關(guān)鍵。

本研究小組對(duì)收集的5千多例食管鱗狀細(xì)胞癌根治術(shù)后切除標(biāo)本全部常規(guī)取材、石蠟包埋，每例原發(fā)灶可獲得500～1 000個(gè)石蠟組織塊，每個(gè)組織塊可連續(xù)收集1 500張病理切片，每張病理切片包含5～8片連續(xù)切片。對(duì)這些病理切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著閱片數(shù)量增加，診斷內(nèi)容明顯增多，甚至有可能推翻原來(lái)的診斷(開(kāi)始有限閱片認(rèn)為是T1，增加深度切片后認(rèn)為是T3)。按照這一程序所產(chǎn)生的工作量，需要的人力和物力，大大超過(guò)了目前醫(yī)院的承受能力。

近年隨著大數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析的快速發(fā)展而誕生的食管癌AI技術(shù)使得人類(lèi)對(duì)海量的食管癌病理資料的有效分析成為可能。食管癌AI研究旨在基于對(duì)病理分類(lèi)和分型、臨床表型、分子分型等各種診療大數(shù)據(jù)的綜合分析，特別是基于病理變化的大數(shù)據(jù)分析，建立各種生物信息學(xué)分析模型，用于預(yù)測(cè)和監(jiān)控食管癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、放化療敏感性、預(yù)后等。利用超算等AI技術(shù)，高通量、快速綜合分析個(gè)體的不同疾病階段的各種檢查結(jié)果，特別是大量病理切片閱讀和分析，不僅可以節(jié)約大量醫(yī)療成本，還可明顯提高診斷的精準(zhǔn)性。

食管癌AI技術(shù)的關(guān)鍵是篩選和甄別特異、敏感、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的臨床流行病學(xué)、病理和分子變量，優(yōu)化組合，建立精準(zhǔn)預(yù)測(cè)模型，為臨床診療提供重要依據(jù)。腫瘤組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞(癌細(xì)胞)和間質(zhì)纖維組織比例的不同，導(dǎo)致腫瘤質(zhì)地不同。據(jù)此提出的食管軟硬癌的分類(lèi)和分型，可能是食管癌AI技術(shù)建模的重要指標(biāo)。

2 食管軟硬癌的分類(lèi)分型

2.1 食管軟、硬癌的分類(lèi)食管軟硬癌最初是胸外科醫(yī)師對(duì)食管癌根治術(shù)開(kāi)胸后食管腫塊質(zhì)地的一種手感描述，并未引起學(xué)者的關(guān)注。20世紀(jì)90年代初，作者在對(duì)手術(shù)離體30 min內(nèi)縱行切開(kāi)食管腫塊取切面(擠壓)腫瘤組織液進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，食管癌組織的質(zhì)地硬度明顯不同，并且明顯影響癌組織液的采集量。系統(tǒng)的病理觀察和分析結(jié)果顯示：①食管硬癌的主要病理特征是癌組織中非常明顯的纖維組織反應(yīng)性增生，呈巢狀或條索狀排列的癌細(xì)胞被大量反應(yīng)性增生的纖維組織包裹或分隔，這可能是導(dǎo)致癌組織質(zhì)地變硬的主要原因。②食管硬癌的癌細(xì)胞周?chē)?，特別是反應(yīng)性增生的纖維組織內(nèi)，常常有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。③食管硬癌常常呈中高分化，多伴隨角化珠或單個(gè)癌細(xì)胞的角化(圖1)。④對(duì)1 350例食管癌病例臨床資料的分析發(fā)現(xiàn)，硬癌占比明顯低于軟癌(16.7%vs83.3%)，硬癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于軟癌患者，硬癌患者預(yù)后明顯好于軟癌患者(中位生存期2.8 avs2.0 a)[10]。⑤硬癌組織中鈣黏蛋白CDH1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于軟癌(82%vs62%)。

根據(jù)食管軟硬癌的臨床和病理特征，我們提出了食管軟、硬癌這一新的臨床分類(lèi)。食管癌組織質(zhì)地軟硬程度可能主要取決于癌間質(zhì)中反應(yīng)性纖維組織增生的程度。食管癌間質(zhì)中的細(xì)胞主要是纖維母細(xì)胞、各類(lèi)淋巴細(xì)胞、各類(lèi)具有吞噬功能的細(xì)胞(單核、巨噬細(xì)胞)、嗜酸性粒細(xì)胞等；此外，癌間質(zhì)中還有豐富的新生小血管；這些癌性間質(zhì)構(gòu)成了重要的腫瘤微環(huán)境。我們認(rèn)為，隨著癌細(xì)胞的惡性增生和浸潤(rùn)性遷徙，正常組織被累及和破壞，繼而發(fā)生相互對(duì)抗、適應(yīng)和改造，最終形成癌組織。對(duì)抗是指人體免疫細(xì)胞和免疫組織的反應(yīng)性增生，啟動(dòng)人體抗腫瘤免疫反應(yīng)，對(duì)抗癌細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)。適應(yīng)是指在對(duì)抗的過(guò)程中，機(jī)體的抗腫瘤能力被耗竭，或癌細(xì)胞形成抗腫瘤逃逸效應(yīng)，二者間逐漸相互適應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤惡性生物學(xué)行為的滋長(zhǎng)，這是腫瘤惡性進(jìn)展的開(kāi)始。改造是指機(jī)體和癌細(xì)胞之間產(chǎn)生一種新的微環(huán)境，如果這種新環(huán)境有利于癌細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)，機(jī)體將向惡病質(zhì)發(fā)展；反之，特別是糾正免疫逃逸等，機(jī)體將向痊愈方向發(fā)展。反應(yīng)性纖維組織增生可能就是機(jī)體應(yīng)對(duì)癌細(xì)胞的一種改造，增生的纖維組織在一定程度上限制了癌細(xì)胞的擴(kuò)張，這可能是食管硬癌患者生存優(yōu)于軟癌患者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低于軟癌患者的可能原因之一。癌細(xì)胞為獲取更多營(yíng)養(yǎng)以適應(yīng)其惡性增生的需要，生成許多誘導(dǎo)因子導(dǎo)致間質(zhì)血管增生，則是癌細(xì)胞對(duì)機(jī)體的改造之一，從而逐漸形成癌性間質(zhì)。因此，軟、硬癌的分類(lèi)可能不僅僅局限于食管癌。

2.2 食管軟硬癌的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)字病理-AI分析我們?cè)诖颂岢鍪彻苘浻舶┑姆诸?lèi)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)基于實(shí)質(zhì)細(xì)胞(癌細(xì)胞)和間質(zhì)(主要是網(wǎng)狀纖維組織)的比例。首先，利用不同染色方法將癌實(shí)質(zhì)和間質(zhì)明確區(qū)分開(kāi)來(lái)。其次，食管癌間質(zhì)百分比=間質(zhì)總面積(stroma area,SA)/[SA+實(shí)質(zhì)細(xì)胞總面積(cancer cell area,CA)]×100%。最后，依據(jù)間質(zhì)百分比分為3級(jí)：<60%為Ⅰ級(jí)(軟癌)；60%～80%為Ⅱ級(jí)(中度硬癌)；>80%為Ⅲ級(jí)(重度硬癌)?？梢岳媚[瘤細(xì)胞增生相關(guān)指標(biāo)(PCNA或Ki67等)標(biāo)記實(shí)質(zhì)細(xì)胞，利用纖維組織染色(Masson染色等)標(biāo)記間質(zhì)。食管軟硬癌數(shù)字病理-AI分析流程：對(duì)食管癌組織切片進(jìn)行標(biāo)記性染色，將染色結(jié)果掃描成高分辨率電子圖片(數(shù)字切片)，利用數(shù)字病理-AI分析系統(tǒng)計(jì)算食管癌間質(zhì)百分比，按照上述標(biāo)準(zhǔn)判定軟、硬癌性質(zhì)。具體見(jiàn)圖2。

鏡下可見(jiàn)典型的角化珠(綠色箭頭)，巨核細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)

A：食管癌組織芯片；B：Ki67免疫組化染色；C：組織芯片染色結(jié)果掃描；D：AI分析(計(jì)算間質(zhì)百分比)；E、F和G：分別為A、B和C的A7位點(diǎn)放大(10倍)圖像

2.3 食管軟硬癌分類(lèi)的分子基礎(chǔ)本研究小組[11]較早發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在食管上皮癌前病變和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯高表達(dá)。TGF-β1具有刺激Ⅰ型膠原蛋白合成的作用[12]。I型膠原蛋白表達(dá)與許多纖維化疾病相關(guān)，也是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，包括中國(guó)人食管鱗狀細(xì)胞癌[13]。研究[14]提示，結(jié)節(jié)硬化性淋巴瘤預(yù)后較好，該淋巴瘤中存在纖維組織過(guò)度增生，且增生與TGF-β1過(guò)表達(dá)有關(guān)，特別值得注意的是，該淋巴瘤間質(zhì)有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而過(guò)多的TGF-β1被證明來(lái)自這些嗜酸性粒細(xì)胞。研究人員[15]發(fā)現(xiàn)，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)性組織中嗜酸性粒細(xì)胞增多，而且與預(yù)后具有一定相關(guān)性，提示嗜酸性粒細(xì)胞可能參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。本研究小組[16]較早報(bào)道，在從食管正常上皮、基底細(xì)胞過(guò)度增生Ⅰ級(jí)、基底細(xì)胞過(guò)度增生Ⅱ級(jí)到不典型增生病變組織中，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生率分別為0%、2%、4%、60%，呈逐漸升高趨勢(shì)。本研究小組也在食管硬癌間質(zhì)中觀察到大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重時(shí)顯微鏡下幾乎滿視野都是嗜酸性粒細(xì)胞(圖3)。

圖3 食管癌組織中大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

嗜酸性粒細(xì)胞在骨髓中生成時(shí)受IL-5、GM-CSF、IL-3的調(diào)控，其中IL-5能特異性地促進(jìn)該類(lèi)細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟和釋放[17-18]。正常情況下，嗜酸性粒細(xì)胞主要駐留于呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的上皮細(xì)胞和深層組織之間，其確切功能尚不明了。嗜酸性粒細(xì)胞的基礎(chǔ)蛋白和嗜酸性陽(yáng)離子蛋白可以殺傷多種細(xì)胞病原體[19]。嗜酸性粒細(xì)胞能合成多種細(xì)胞因子，如TGF-α和β、血小板活化因子、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、IL-12等，其中TGF-α和β能促進(jìn)創(chuàng)口愈合和纖維化，IL-12可能與Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。研究者[21]還發(fā)現(xiàn)氣道炎癥模型小鼠體內(nèi)異常增加的嗜酸性粒細(xì)胞可分泌趨化因子C-C基序配體6(C-C motif chemokine ligand 6，CCL6)，后者可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果提示，嗜酸性粒細(xì)胞在參與正常免疫防御反應(yīng)的同時(shí)，也能造成組織細(xì)胞的損傷；嗜酸性粒細(xì)胞可能通過(guò)直接作用于腫瘤細(xì)胞，或通過(guò)腫瘤微環(huán)境的間接作用，調(diào)控腫瘤進(jìn)展。

綜上，我們提出嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、TGF-β1、纖維組織反應(yīng)性增生間可能存在重要的互作關(guān)系(圖4)，這可能是食管硬癌的重要分子基礎(chǔ)。食管軟硬癌分子機(jī)制尚需更多的研究加以闡明。

圖4 嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、TGF-β1、纖維組織反應(yīng)性增生互作關(guān)系

3 食管軟硬癌研究的意義和展望

食管癌間質(zhì)組織是食管癌微環(huán)境的重要組成部分，包含許多免疫相關(guān)細(xì)胞。網(wǎng)狀纖維組織，特別是其中的膠原纖維，為這些免疫相關(guān)細(xì)胞提供了重要的結(jié)構(gòu)支撐。如果從“種子”和“土壤”的關(guān)系理解[22]，食管癌間質(zhì)百分比或許反映了種子和土壤的比例。反應(yīng)性增生的網(wǎng)狀纖維組織分隔和包裹癌細(xì)胞，起到阻遏癌細(xì)胞擴(kuò)散的作用，這可能是硬癌患者生存期優(yōu)于軟癌患者，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率低的原因；同時(shí)，這種阻遏作用可能也影響化療藥物進(jìn)入癌組織，降低化療療效。闡明反應(yīng)性纖維組織增生的機(jī)制，可以為食管癌的生物靶向治療提供新的研究方向。基于數(shù)字病理大數(shù)據(jù)，軟硬癌病理形態(tài)特征很容易被AI分析系統(tǒng)識(shí)別量化，為AI技術(shù)開(kāi)展提供了重要客觀指標(biāo)。硬癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚，可以預(yù)見(jiàn)，食管軟硬癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)可能與食管癌免疫微環(huán)境關(guān)系密切。對(duì)食管軟硬癌(免疫微環(huán)境)分子機(jī)制研究的深入可能帶來(lái)一種新的觀念和策略：一改以往單純針對(duì)癌細(xì)胞的治療策略，開(kāi)始從改造微環(huán)境入手，形成不利于或限制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，最終達(dá)到根治腫瘤的目的。