消痰散結(jié)方聯(lián)合放療對(duì)肺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡、免疫功能及腫瘤標(biāo)志物的影響*

劉香來 劉繼微 李海川 李明利

（1.河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院，河北 廊坊 065000 2.河北省廊坊愛德堡醫(yī)院，河北 廊坊 065000；3.河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056000）

有研究表明，細(xì)胞凋亡一旦發(fā)生紊亂就會(huì)引發(fā)人類多種疾病，肺癌也不例外，肺癌細(xì)胞的異常凋亡一直被認(rèn)為是肺癌持續(xù)發(fā)展的必要因素［1-3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者通常免疫功能低下，且這類患者極易發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，故可推測(cè)肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移與患者機(jī)體免疫功能低下存在一定關(guān)系，因此如何提高免疫功能已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一［4］。腫瘤標(biāo)志物是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)，其存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，繼而了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，故對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)是腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)的重要指標(biāo)［5］。目前在治療肺癌方面現(xiàn)代醫(yī)學(xué)占據(jù)主導(dǎo)地位，如手術(shù)治療、分子靶向、放化療、免疫治療等，其中放射治療是中晚期肺癌首選和最主要的治療方法［6］。近年來，中藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已成為開發(fā)治療癌癥藥物的重要途徑之一，其中“化痰散結(jié)法”是中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的重要方法，由此制成的化痰散結(jié)方具有健脾益氣、扶正祛邪、化痰散結(jié)之功效，可多方位、多靶點(diǎn)、多步驟地抑制腫瘤生長(zhǎng)，并阻止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，最終達(dá)到抗腫瘤的目的［7］。因此，本文就消痰散結(jié)方聯(lián)合放療對(duì)肺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡、免疫功能及腫瘤標(biāo)志物影響進(jìn)行研究探討，為臨床治療提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)SD雄性大鼠，由廣州弗爾博生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（粵）2020-0058，體質(zhì)量200～250g。大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫生長(zhǎng)，模仿12 h晝夜交替，在常溫下進(jìn)行無菌自由進(jìn)食、飲水2周，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥及儀器

消痰散結(jié)方（制半夏20 g，蒼術(shù)、神曲、白術(shù)、香附、夏枯草、太子參、僵蠶、白芥子、白附子各10 g，浙貝母、魚腥草、瓜蔞各20 g，陳皮、炙甘草各6 g），制備為生藥含量約為5.35 g/mL的煎劑備用。碘化油（貨號(hào)：H37022398，煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司）；3-甲基膽蒽（貨號(hào)：30050029，深圳海思安有限公司）；二乙基亞硝胺（貨號(hào)：YJ-P222710，上海一基有限公司）；蘇木素染液（貨號(hào)：H9627，美國(guó)Sigma公司）；伊紅染液（貨號(hào)：AG1100-100 mL，上海吉至有限公司）。光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：CX-60，日本OLYMPUS公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KFS197-EGF，北京百奧萊博有限公司）；DAPI染色液（貨號(hào)：FT21949yy，上海梵態(tài)有限公司）；CD3+細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：J20180312，南京百奧有限公司）；CD4+細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：J20171103，南京百奧有限公司）；CD8+細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：J20180506，南京百奧有限公司）；NKT細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：J11030071，北京同立海源有限公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：BD FACSCantoⅡ，上海遠(yuǎn)耀有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：446502，美國(guó) R＆D公司）。

1.3 模型制備

隨機(jī)選取50只大鼠，禁食12 h后，肌肉注射5萬U青霉素鈉及50 mg鏈霉素以預(yù)防肺部感染。腹腔注射40 mg/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定好后將注射器插入肺葉支氣管并緩慢注入0.1 mL致癌碘化油（含3-甲基膽蒽5 mg及二乙基亞硝胺0.01 mL），用高分辨率數(shù)字小動(dòng)物X線機(jī)進(jìn)行胸部影像學(xué)檢查，當(dāng)觀察到肺部腫物形成時(shí)，則視為建模成功，造模過程中大鼠死亡6只，其余均建模成功。

1.4 分組與給藥［8］

選取建模成功的大鼠40只，隨機(jī)分為模型組、中藥組、放療組、消痰散結(jié)方聯(lián)合放療組，每組10只。剩余10只健康大鼠作為正常組。根據(jù)人與大鼠換算比計(jì)算，中藥組每只大鼠灌胃4 mL消痰散結(jié)方煎劑，每天1次，共28 d。同時(shí)，放療組采用高能直線加速器，在200 cGy/min的固定劑量下進(jìn)行6 MV-X射線放射治療，2 d 1次，共28 d。聯(lián)合組給予消痰散結(jié)方聯(lián)合放療治療，方法與中藥組和放療組相同，給藥后24 h進(jìn)行放射治療。正常組、模型組每日給予同體積生理鹽水灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

給藥結(jié)束24 h后，稱重后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，采集肺部動(dòng)脈血，然后取雙肺及腫瘤組織。肺血離心后取上清液于冰箱中密封保存。雙肺用4%的多聚甲醛固定96 h，生理鹽水漂洗干凈，放入冰箱中密封保存。腫瘤組織稱重，稱重后對(duì)其長(zhǎng)徑及短徑進(jìn)行測(cè)量，按照公式［（長(zhǎng)徑×短徑2）÷2］計(jì)算瘤體體積。

1.5.1 肺病理組織HE染色 取各組右肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行HE染色，染色完成后除去多余染液，進(jìn)行脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片處理，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.5.2 末端脫氧核苷酸標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡 取各組左肺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟后，將切片置于3%過氧化氫中浸泡10 min，PBS洗滌3次，加入蛋白酶K后進(jìn)行室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，然后緩沖液標(biāo)記2 h，封閉液封閉30 min，甩掉封閉液后，加入稀釋的生物素化抗地高辛抗體（1∶100），在37℃溫育箱中反應(yīng)30 min，加入稀釋的SABC-FITC抗體（1∶100），在37℃溫育箱中反應(yīng)30 min，PBS洗滌4次后，用DAPI染色液進(jìn)行染色，染色完成后用抗熒光衰減封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，黃綠色熒光顆粒在細(xì)胞核中的為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)視野下的細(xì)胞計(jì)算凋亡率，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清免疫功能相關(guān)指標(biāo) 取大鼠血清，加入10 μL CD3+、10 μL CD4+、10 μL CD8+、10 μL NKT抗體和50 μL EDTA抗凝血，震蕩混合均勻后溫室避光孵育20 min，加入2 mL溶血素孵育20 min，在1 400 r/min的條件下離心7 min，棄掉上清液，加入2 mL的PBS再次離心7 min，棄掉上清液，加2 mL PBS重懸混勻，上流式細(xì)胞儀機(jī)帶軟件分析CD3+、CD4+、CD8+和NKT，用自帶軟件區(qū)分不同細(xì)胞，顯示細(xì)胞含量，并計(jì)算各細(xì)胞的百分比。

1.5.4 ELISA法檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物水平 取各組大鼠血清，檢測(cè)癌胚抗原（CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、糖類抗原125（CA125）等腫瘤標(biāo)志物水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)完成后，立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定每孔吸光度，計(jì)算血清中CEA、NSE、CA125含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism8.0對(duì)各組大鼠癌細(xì)胞凋亡、免疫功能及腫瘤標(biāo)志物相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)、多組間比較采用單因素方差分析，描述以（）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積比較

見表1。與正常組相比，模型組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05），腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積顯著降低（P＜0.05）；與中藥組相比，放療組體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積無明顯差異（P＞0.05）；與放療組和中藥組相比，聯(lián)合組體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05），腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05；與聯(lián)合組比較，△P＜0.05。下同。

組別正常組模型組中藥組放療組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10體質(zhì)量（g）239.66±10.99 164.33±9.74*195.25±10.08*#△195.67±10.01*#△229.59±10.31*#腫瘤質(zhì)量（mg）0 105.88±5.12*90.44±5.01*#△90.60±5.03*#△74.32±4.86*#腫瘤體積（cm3）0 1.25±0.02*0.74±0.02*#△0.75±0.03*#△0.33±0.02*#

2.2 各組HE染色結(jié)果

正常組肺組織結(jié)構(gòu)、肺泡正常完整，排列整齊，間質(zhì)均勻且無充血。模型組可見肺泡囊明顯擴(kuò)張，肺間質(zhì)明顯增厚，纖毛上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯破損，可見大量炎性細(xì)胞及癌細(xì)胞浸潤(rùn)，核仁明顯，排列紊亂并伴有腺樣或乳頭狀結(jié)構(gòu)。與模型組比較，中藥組、放療組、聯(lián)合組病理結(jié)構(gòu)明顯改善，炎性細(xì)胞及癌細(xì)胞明減少。

2.3 各組大鼠癌細(xì)胞凋亡情況比較

正常組未見癌細(xì)胞，其余組均出現(xiàn)癌細(xì)胞，模型組、中藥組、放療組、聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為（5.33±1.02）%、（20.67±2.69）%、（20.69±2.71）%、（33.47±3.50）%（P＜0.01）。與模型組相比，中藥組癌細(xì)胞凋亡明顯升高（P＜0.05）；與中藥組相比，放療組癌細(xì)胞凋亡無明顯差異（P＞0.05）；與放療組和中藥組相比，聯(lián)合組癌細(xì)胞凋亡明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織癌細(xì)胞凋亡熒光圖（200倍）

2.4 各組大鼠血清免疫功能指標(biāo)比較

見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清CD3+、CD4+細(xì)胞含量顯著降低（P＜0.05），CD8+、NKT細(xì)胞含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、放療組、聯(lián)合組大鼠血清CD3+、CD4+細(xì)胞含量顯著升高（P＜0.05），CD8+、NKT細(xì)胞含量顯著降低（P＜0.05），且放療組與中藥組相比基本無差異（P＞0.05），聯(lián)合組比放療組、中藥組變化顯著（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、NKT細(xì)胞含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、NKT細(xì)胞含量比較（±s）

組別正常組模型組中藥組放療組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 CD3+69.55±3.01 40.26±2.59*52.25±2.78*#△52.33±2.81*#△63.39±2.86*#CD4+45.78±2.21 30.88±1.58*35.66±1.74*#△35.64±1.75*#△42.18±2.01*#CD8+23.74±1.14 35.25±2.02*30.47±1.79*#△30.49±1.81*#△25.33±1.55*#NKT 2.47±0.27 4.25±0.52*3.66±0.41*#△3.64±0.42*#△2.69±0.31*#

2.5 各組大鼠血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平比較

見表3。與正常組比較，模型組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、放療組、聯(lián)合組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平顯著降低（P＜0.05），且放療組與中藥組相比基本無差異（P＞0.05），聯(lián)合組比放療組、中藥組降低顯著（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平比較（±s）

組別正常組模型組中藥組放療組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 CEA（ng/mL）30.66±2.89 240.26±8.59*149.51±6.77*#△149.55±6.78*#△80.39±4.54*#NSE（ng/mL）55.85±4.26 530.94±12.58*195.66±8.74*#△195.68±8.76*#△96.44±6.01*#CA125（μg/mL）45.69±3.88 335.25±12.02*140.47±8.79*#△140.45±8.81*#△71.28±5.06*#

3 討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率及死亡率正在以世界性趨勢(shì)增長(zhǎng)，已經(jīng)被列為重點(diǎn)防治癌癥之一，因此探尋一種有效的治療手段對(duì)提高患者生存率將具有深遠(yuǎn)意義［9］。本文就消痰散結(jié)方聯(lián)合放療對(duì)肺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡、免疫功能及腫瘤標(biāo)志物影響進(jìn)行研究探討，為中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤提供新的思路和方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可顯著提高大鼠體質(zhì)量，抑制腫瘤生長(zhǎng)，并改善大鼠肺組織病理形態(tài)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。對(duì)許多癌癥患者而言，放射治療是必須的治療方法，但其副作用明顯。研究表明放療與中藥聯(lián)合使用可以降低放療副作用的影響［10］。消痰散結(jié)方是我院根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)改進(jìn)而成的中藥抗癌新藥，本方合于病機(jī)，章法分明，各種藥物配伍合理，具有扶正固本、邪去正安、燥濕化痰、消痞散結(jié)、通絡(luò)止痛之功效，且其在抗腫瘤方面已得到證實(shí)［11］。肺癌在中醫(yī)中屬于“肺積”“痰飲”等范疇，主要由邪毒侵肺、正七虛損、痰瘀內(nèi)積所致，故治療應(yīng)以健脾益氣、扶正祛邪以及化痰散結(jié)為主［12］。對(duì)于肺癌大鼠，放療可直接殺傷癌細(xì)胞從而到達(dá)治療的目的，消痰散結(jié)方則主要通過扶正祛邪、化痰散結(jié)等功效來中和放療的毒副作用，促進(jìn)血液循環(huán)，從而抑制腫瘤血管的生成、抑制黏附分子表達(dá)等，進(jìn)而促進(jìn)凋亡相關(guān)通路的激活，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的目的。王朔等［13］研究表明，對(duì)于肺癌細(xì)胞，冬凌草乙素聯(lián)合放療具有協(xié)同作用，與單純放療相比，更能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這與本文結(jié)果類似。

免疫功能是指機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力，其可抵抗和清除病原微生物或其他異物，并清除損傷或衰老的細(xì)胞以維持機(jī)體的生理平衡，同時(shí)其還可以識(shí)別和清除體內(nèi)出現(xiàn)的突變細(xì)胞，防止腫瘤的發(fā)生，故如何提高機(jī)體免疫功能一直是肺癌專家關(guān)注的焦點(diǎn)及熱點(diǎn)［14］。本研究表明，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可顯著大鼠免疫功能。CD3+、CD4+、CD8+、NKT細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，研究表明，其在人體內(nèi)對(duì)腫瘤起著非常重要的免疫作用，故檢測(cè)其數(shù)量的變化可有效反映機(jī)體免疫功能水平［15］。而對(duì)于肺癌大鼠，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可能是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，來增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞對(duì)碳粒的吞噬功能以及體液免疫功能，從而加強(qiáng)血液和淋巴循環(huán)以及離子的運(yùn)轉(zhuǎn)、減弱腫瘤細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)，進(jìn)而有效改善機(jī)體免疫狀態(tài)，最終改善大鼠免疫功能。陳稀煩等［16］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌大鼠CD3+、CD4+細(xì)胞含量顯著降低，CD8+、NKT細(xì)胞含量顯著升高，治療后其含量明顯改善，說明大鼠免疫功能顯著改善，這與本文結(jié)果類似。

本文研究發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可顯著降低腫瘤標(biāo)志物水平。眾所周知，血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是腫瘤早期篩查、臨床診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)，其簡(jiǎn)便、有效、易行，故近年來越來越受到各方面的關(guān)注［17］。而CEA、NSE、CA125是肺癌最常檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物，其給肺癌臨床早期診斷、病理分期、組織學(xué)分型、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估方面帶來了很大價(jià)值［18-19］。而對(duì)于肺癌大鼠，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可能是通過內(nèi)治和外治相結(jié)合來調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)，從而減少或抑制腫瘤周圍炎性分泌物的產(chǎn)生、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)活性、抑制內(nèi)皮活性因子的分泌等，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、阻斷腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的目的，最終促使血清腫瘤標(biāo)志物降低。李明利等［20］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于肺癌患者，化痰逐瘀散結(jié)湯/消痰散結(jié)方聯(lián)合放化療具有顯著療效，可顯著提高肺癌緩解率，并降低患者血清腫瘤標(biāo)志物水平，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，消痰散結(jié)方聯(lián)合放療可顯著促進(jìn)肺癌大鼠癌細(xì)胞凋亡，提高其免疫功能，并降低腫瘤標(biāo)志物的水平。