天香丹對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響*

張 華 苗文艷 徐正偉 葉成輝 安冬青，3△

（1.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州中醫(yī)醫(yī)院，新疆 昌吉 831100；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000）

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。–VD）已成為全球人口死亡的首要原因，炎癥反應(yīng)貫穿了動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展的始終［1-3］。研究表明，當(dāng)組織受損時(shí)，可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)從而激活Toll樣受體-4（TLR4），引起核因子-κB（NF-κB）磷酸化，介導(dǎo)下游因子發(fā)生炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)引發(fā)AS［4-6］。目前針對(duì)CVD的治療，即使是降血脂、抗血小板與控制血壓的藥物也只能降低部分CVD事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［7-9］，且存在一定的副作用，所以仍缺乏積極有效的防治措施。AS的發(fā)生多由內(nèi)外之邪引發(fā)臟腑功能失調(diào)、氣血津液運(yùn)行障礙導(dǎo)致，治療可運(yùn)用清熱解毒且氣味芳香、性善走竄之品清解“內(nèi)外之毒”。天香丹是名老中醫(yī)張絢邦教授以通補(bǔ)開泄法為理論總結(jié)而成的經(jīng)驗(yàn)方，該方以新塔花為君，紅景天、丹參為臣，佐以降香4味中藥按特定比例組成，有化痰散結(jié)、益氣補(bǔ)虛、和血通絡(luò)的作用，可用于防治AS性心血管疾病。臨床研究表明，其在調(diào)節(jié)血脂代謝、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)等方面療效確切，但防治AS機(jī)制尚需進(jìn)一步研究［10-14］。本研究通過建立AS小鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)，后期進(jìn)行病理學(xué)實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察TLR4/NF-κB通路下游相關(guān)炎癥因子、血脂水平指標(biāo)、血管病理性變化等，旨在為中醫(yī)藥防治AS性心血管病、開發(fā)新的中醫(yī)藥資源提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠 30只，普通C57BL/6J小鼠10只，平均體質(zhì)量（18.00±2.00）g，均由北京維通利華公司購入，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF環(huán)境，并通過倫理委員會(huì)審批，編號(hào)：MEC-20210214-001。

1.2 試藥與儀器 阿托伐他?。ū本㏒olarbio公司，批號(hào)：20151223）；天香丹（新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)院，批準(zhǔn)號(hào)：新藥制字ZO4000820）。高脂飼料（成分：基礎(chǔ)飼料82.68%、豬油10%、豬膽鹽0.2%、膽固醇2%、蔗糖5%、丙硫氧基嘧啶0.12%），由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心加工而成。小鼠TLR4 ELISA試劑盒（美國EBioscience）、小鼠NF-κB ELISA試劑盒（美國EBioscience公司）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（美國EBioscience）、HE染色試劑盒（G1120，北京Solarbio）等。PM-401石蠟熔蠟箱（日本SAKURA）；5235組織包埋機(jī)（日本SAKURA）；LKB-V切片機(jī)（瑞典LKB）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendrof）；DM 2500光學(xué)顯微鏡（德國LEIC）；Type 1500多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo）等。

1.3 造模與分組 所有小鼠于SPF級(jí)環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)8周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。以ApoE-/-小鼠為標(biāo)準(zhǔn)，肉眼觀察見小鼠反應(yīng)遲鈍，精神倦怠，皮毛干枯無光澤且稀疏，體質(zhì)量增加明顯。病理學(xué)實(shí)驗(yàn)，鏡下觀察見小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜纖維性增厚鈣化，管腔狹窄明顯，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，有脂質(zhì)沉積，出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶或粥樣斑塊等。以上證實(shí)AS模型制備成功。造模成功后，將C57BL/6J小鼠設(shè)為空白對(duì)照組，ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、他汀組和天香丹組，每組10只。

1.4 給藥方法 根據(jù)成人臨床常用量等效換算［15］，小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量=9.1×成人臨床常藥量［g（/kg·d）］。將藥物溶于0.5 mL蒸餾水（小鼠最大灌胃劑量0.4 mL/10 g）灌胃，每日1次，每周根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整劑量。他汀組灌胃阿托伐他汀藥液3 mg（/kg·d）、天香丹組灌胃天香丹藥液2.7 g（/kg·d），模型組和空白組灌胃0.5 mL蒸餾水，持續(xù)12周。所有小鼠SPF環(huán)境喂養(yǎng)，不限飲食飲水，活動(dòng)自由。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 第12周末，禁食不禁水12 h，小鼠麻醉后眼球取血至EP管內(nèi)，7 500 r/min離心15 min取上清，-80℃冰箱保存；無菌條件下迅速打開胸腹腔，取胸腹主動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定。1）血脂檢測(cè)。自動(dòng)生化儀測(cè)量血清CHO、三酰甘油（TAG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。AS指數(shù)（AI）=（CHO-HDL）/HDL。2）HE染色和斑塊面積分析。取甲醛固定的主動(dòng)脈依次經(jīng)過組織包埋、固定、脫水、切片、染色、拍照等步驟，利用圖像分析軟件測(cè)量陽性面積，計(jì)算主動(dòng)脈斑塊面積（PA）/管腔面積（LA）值，觀察病變部位及形態(tài)學(xué)變化。3）ELISA法測(cè)血清中TLR4、NF-κB、TNF-α含量，試劑盒測(cè)定各組小鼠血清中細(xì)胞因子TLR4、NF-κB、TNF-α表達(dá)水平，以酶標(biāo)儀450 nm波長為條件，計(jì)算出相應(yīng)因子的濃度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Tamhane's T2）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和一般情況比較 見表1。灌胃第12周末，空白組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，暴躁好斗，皮毛干凈，飲食飲水及二便正常，體質(zhì)量增加不顯著。模型組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜靜少動(dòng)，皮毛干枯無澤且脫落，飲食飲水較模型組降低，體質(zhì)量較空白組增加明顯（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組、天香丹組小鼠均表現(xiàn)喜靜少動(dòng)，皮毛干枯有脫落，飲食飲水減少，體質(zhì)量增加緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。他汀組與天香丹組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10初始體質(zhì)量18.02±1.13 18.01±2.05 18.10±3.30 18.06±0.92灌胃第2周19.26±0.35 21.41±0.57*20.06±1.12 20.52±1.26灌胃第6周24.24±1.17 28.11±2.10*25.06±1.20△△26.31±1.51△△灌胃第12周27.22±1.31 35.65±2.35*29.34±1.15△△30.22±1.35△△

2.2 各組小鼠血清血脂水平比較 見表2。與空白組比較，模型組TAG、TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組、天香丹組TAG及TC降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），天香丹組HDL-C升高，LDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），他汀組HDL-C和LDLC變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。他汀組與天香丹組小鼠血脂水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（mmol/L，±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 TAG 0.64±0.01 1.34±0.07*0.97±0.08△△0.85±0.15△△TC 2.75±0.04 15.32±1.01*13.53±2.86△△9.81±0.08△△HDL-C 2.17±0.10 0.62±0.01*0.63±0.08 0.99±0.07△△LDL-C 0.36±0.06 5.84±0.94*6.04±0.19 3.86±0.33△△

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化 見圖1、表3。所有小鼠均見AS的形成，管腔出現(xiàn)不同程度的狹窄?？瞻捉M小鼠主動(dòng)脈壁未見明顯平滑肌細(xì)胞增生，未見膽固醇結(jié)晶形成，少量狹窄。模型組斑塊增多，主動(dòng)脈壁厚度明顯不均勻，局部發(fā)生鈣化，外膜可見大量炎性細(xì)胞浸潤及斑塊形成，PA/LA比值顯著大于空白組（P＜0.01）。他汀組、天香丹組主動(dòng)脈管壁厚度不均勻，內(nèi)膜增厚，但小于模型組，外膜內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，病理改變較模型組輕，兩組PA/LA比值均小于模型組（P＜0.01）。他汀組與天香丹組PA/LA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈病理觀察（HE染色，200倍）

表3 各組小鼠主動(dòng)脈PA/LA值比較（±s）

表3 各組小鼠主動(dòng)脈PA/LA值比較（±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 PA/LA（%）0.12±0.04 0.67±0.19*0.23±0.15△△0.25±0.10△△

2.4 各組小鼠血清細(xì)胞因子TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較 見表4。模型組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比，他汀組、天香丹組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。他汀組與天香丹組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 TLR4 1.04±0.38 7.54±1.76*2.05±0.57△△3.90±0.76△NF-κB 1.07±0.16 5.93±1.70*1.79±0.63△△2.01±0.71△△TNF-α 706.65±100.17 1 655.54±258.98*1 219.68±150.87△△1 248.46±149.83△△

3 討 論

中醫(yī)根據(jù)AS臨床癥狀將其歸屬于“胸痹”“真心痛”“脈痹”“中風(fēng)”等范疇。名老中醫(yī)張絢邦教授認(rèn)為，該病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為心肝之血、肺脾腎精元之氣不足，標(biāo)實(shí)為氣滯血瘀痰阻，治當(dāng)以通補(bǔ)開泄為法。天香丹為通補(bǔ)開泄法代表方，口服療效較好，臨床運(yùn)用三十余年，在抗AS、改善心肌缺血等方面具有良好療效。

國內(nèi)外對(duì)于TLR4/NF-κB信號(hào)通路的報(bào)道很多。NF-κB是一種特殊蛋白，它首先成熟在B細(xì)胞和漿細(xì)胞中，并廣泛存在于人體組織細(xì)胞中。在AS病變過程中，其主要特征是血管壁發(fā)生炎癥反應(yīng)。越來越多的研究表明［16-17］，TLR4在CVD的最初發(fā)展中起著重要作用，即使在斑塊不穩(wěn)定及破裂過程中亦是如此，其介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路已成了治療CVD的新靶點(diǎn)。當(dāng)出現(xiàn)組織受損時(shí)，TLR4通路被活化，從而激活NF-κB，釋放大量的炎癥因子，出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙、炎癥、血管壁變薄等，增加不穩(wěn)定性因素，引起斑塊的破裂和血栓形成，導(dǎo)致心血管病事件發(fā)生［18-19］。課題組前期研究表明［12-14］，天香丹能夠有效緩解心絞痛的發(fā)作，調(diào)節(jié)血脂水平，以及提高患者血清內(nèi)皮生長因子含量，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞受損，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，通過高脂飼料喂養(yǎng)可成功建立AS小鼠模型，而天香丹組小鼠體質(zhì)量較模型組偏低，血脂有所改善（P＜0.01），主動(dòng)脈炎性浸潤及脂質(zhì)沉淀減少，血管內(nèi)皮病理情況有所緩解，且未見明顯斑塊形成，天香丹組主動(dòng)脈PA/LA比值小于模型組（P＜0.01），提示天香丹能夠降低AS小鼠體質(zhì)量、調(diào)節(jié)血脂，改善內(nèi)皮功能，減輕炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清中TLR4、NF-κB、TNF-α含量均低于模型組，與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這提示天香丹可能是通過降低TLR4/NF-κB信號(hào)通路內(nèi)蛋白水平，介導(dǎo)下游細(xì)胞因子，最終達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)，防治AS的作用。

總之，本研究基于炎癥角度探討了天香丹防治AS的機(jī)制，對(duì)今后中醫(yī)藥抗AS尋找新的靶點(diǎn)進(jìn)行了探索，認(rèn)為其抗AS效果可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，但并不能確定天香丹抑制炎癥為其防治AS的唯一途徑。天香丹內(nèi)具體哪些成分起到了靶向作用，還需對(duì)藥效學(xué)和機(jī)制展開深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。