基于Wnt/β-catenin通路探討通心絡(luò)膠囊對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠炎癥水平的影響*

姜雪嬌 李金霞 張秋云△ 宗文靜

（1.首都醫(yī)科大學，北京 100069；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；3.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700）

動脈粥樣硬化（AS）是多種原因?qū)е碌难装Y性血管疾病，其特征是在動脈壁上出現(xiàn)脂質(zhì)堆積和纖維斑塊，是多種心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，也是目前世界上導(dǎo)致成人死亡的主要原因之一［1-3］。Wnt通路最早在腫瘤疾病中被發(fā)現(xiàn)，但是近年來研究顯示W(wǎng)nt通路在粥樣硬化性心血管疾病中也有重要作用［1-2］，在AS的發(fā)展過程中Wnt信號通路被激活，游離的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）導(dǎo)致炎癥因子釋放，進而引起血管內(nèi)皮屏障破壞［3］、血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和細胞外基質(zhì)礦化（ECM）［4］。

通心絡(luò)膠囊是依據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論而制成的中藥復(fù)方，前期研究表明通心絡(luò)膠囊在治療AS性疾病中起到重要作用［5］，如降低血脂水平，改善患者微炎癥狀態(tài)［6］，減少 AS斑塊面積［7］，改善心臟功能和血管舒張，抑制含主動脈斑塊的血管生成［8］，可有效防治AS。然而通心絡(luò)膠囊對AS的治療作用是否與Wnt/β-catenin通路有關(guān)，目前尚不清楚。在本研究中，我們利用ApoE-/-小鼠建立AS模型，觀察了Wnt/β-catenin通路的相關(guān)因子變化及通心絡(luò)膠囊的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10周齡ApoE-/-小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房，每籠2只，室溫18～23℃，濕度（50.0±2.0）%，每隔12 h開燈照明，自由飲食攝水。本研究嚴格按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南中的建議進行。協(xié)議得到了首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準（批號：AEEI-2020-079），并盡一切努力減少動物的痛苦。

1.2 藥物與試劑

通心絡(luò)膠囊膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z19980015），阿托伐他?。ㄈ疠x制藥，國藥準字J20030047）。高脂飲食（含膽固醇0.15%、脂肪21%），購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。生理鹽水、蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、電泳緩沖液、電轉(zhuǎn)緩沖液、脫脂專用封閉奶粉、Wnt1抗體（Proteintech，27935-1-AP）、Wnt3a抗體（Abcam，ab219412）、β-catenin抗體（Proteintech，66379-1-Ig）、5×蛋白上樣緩沖液、4%多聚甲醛。

1.3 造模及干預(yù)［8-9］

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組6只（正常飲食，8周后每日給予生理鹽水1 mL/10 g），高脂飲食組18只（高脂飲食）。造模8周后隨機分為模型組6只，高脂飲食，每日給予生理鹽水1 mL/10 g；通心絡(luò)膠囊組6只，高脂飲食，每日予通心絡(luò)膠囊1.5 g/kg；阿托伐他汀組6只，高脂飲食，每日給予阿托伐他汀4.8 mg/kg。各組均持續(xù)灌胃給藥8周。

1.4 標本制備與檢查

1.4.1 主動脈形態(tài)學檢查 收集ApoE-/-小鼠主動脈根部，用4%多聚甲醛固定，樣品用OCT包埋，冰凍切片4 μm。然后利用蘇木精和伊紅（HE）、油紅-O染色分析AS斑塊病變。光鏡下觀察主動脈弓組織內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及AS斑塊表現(xiàn)，并在高倍視野下拍照。觀察通心絡(luò)膠囊對主動脈結(jié)構(gòu)及斑塊面積的影響。

1.4.2 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白表達 收集各組小鼠的主動脈組織，按照蛋白定量試劑盒的說明檢測蛋白濃度并定量。使用10%SDS聚丙烯凝膠電泳后，在300 mA下將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜中40 min，然后用5%脫脂奶粉密封2 h，入Wnt抗體（1∶1 000）、Wnt3a抗體（1∶1 000）、βcatenin抗體（1∶1 000）孵育過夜。TBST洗滌后，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，以GAPDH作為參考，利用化學成像分析儀進行分析，然后利用Image J進行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-6、TNF-α含量 收集小鼠血液，4℃過夜后于2～8℃3 000 r/min離心15 min獲取血清，按照試劑盒說明依次進行稀釋、包被、封閉、洗滌等步驟，然后在酶標儀上，于450 nm處以空白為對照孔調(diào)零后測各孔OD值，并計算血清中IL-6、TNF-α的水平。

1.4.4 實時熒光定量聚合物酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測Wnt1、Wnt3a、β-catenin mRNA表達 使用Trizol提取小鼠主動脈中的總RNA，并使用試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，利用熒光染料進行擴增，擴增條件為預(yù)變性95℃，10 min；熱循環(huán)95 ℃，15 s，退火60℃，30 s，共循環(huán)40次；溶解曲線，60～95℃，每15秒升溫0.3℃。采用2-ΔΔCT法計算mRNA表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)分析均由GraphPad軟件完成。計量資料以（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊情況觀察

見圖1。與正常組相比較，模型組小鼠血管管腔內(nèi)斑塊面積增加，脂質(zhì)沉積明顯，同時內(nèi)膜下見大量泡沫細胞聚集，脂肪空泡形成，說明高脂飲食可以促進AS的發(fā)展，而通心絡(luò)膠囊組和阿托伐他汀組可以明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的斑塊面積，內(nèi)膜增生減輕。

圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部的病理變化（HE、油紅O染色；A、C為50倍，B、D為100倍）

2.2 各組Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白水平比較

見圖2、表1。與正常組相比較，模型組Wnt、Wnt3a、β-catenin的蛋白水平明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比較，通心絡(luò)膠囊組與阿托伐他汀組的Wnt、Wnt3a、β-catenin表達量均呈降低趨勢（P＜0.01），其中阿托伐他汀組的β-catenin下降水平不明顯；與阿托伐他汀組相比較，通心絡(luò)膠囊組3種蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白表達

表1 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白表達水平比較（±s）

表1 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡(luò)膠囊組n 3 3 3 3 Wnt1/GAPDH 1.04±0.16 1.72±0.13*1.07±0.16△△1.02±0.06△△Wnt3a/GAPDH 1.13±0.08 1.75±0.07*1.21±0.14△△1.28±0.10△△β-catenin/GAPDH 1.06±0.12 1.93±0.11*1.44±0.32 1.10±0.09△△

2.3 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較

見表2。與正常組相比較，模型組小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比較，通心絡(luò)膠囊組和阿托伐他汀組 Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平明顯降低（P＜0.01），但是通心絡(luò)膠囊對Wnt3a的降低趨勢不明顯（P＞0.05）。

表2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較（±s）

表2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較（±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡(luò)膠囊組n 3 3 3 3 Wnt1/GAPDH 1.06±0.47 2.24±0.10*1.41±0.19△1.14±0.14△△Wnt3a/GAPDH 0.70±0.06 2.02±0.20*1.22±0.08△1.70±0.11 β-catenin/GAPDH 1.01±0.18 2.78±0.07△△1.28±0.24△△1.23±0.34△△

2.4 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較

見表3。與正常組相比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，阿托伐他汀組和通心絡(luò)膠囊組能夠明顯降低TNF-α、IL-6的含量（P＜0.01）。

表3 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較（pg/mL，±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡(luò)膠囊組n 3 3 3 3 TNF-α 4.34±1.51 16.31±3.69*5.99±0.83△△6.76±0.96△△IL-6 3.53±1.39 10.53±1.37*5.92±2.18△△4.88±1.59△△

3 討 論

AS的特征是彈性動脈內(nèi)膜的纖維組織和脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致血栓形成和結(jié)構(gòu)損傷，血管壁增厚和硬化［10］。晚期AS斑塊可侵犯動脈腔，阻礙血流，導(dǎo)致組織缺血，同時還可以引發(fā)血栓的形成，阻塞管腔，導(dǎo)致缺血的再次發(fā)生，甚至危及生命。AS的發(fā)病機制比較復(fù)雜，其中炎癥是重要的病理基礎(chǔ)。研究顯示炎癥在AS的發(fā)展過程中可以促進脂質(zhì)條紋和纖維斑塊的形成、增加斑塊的不穩(wěn)定性［11-13］。

Wnt通路由Wnt蛋白家族、細胞膜卷曲受體、共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6、下游轉(zhuǎn)錄因子（Dvl APC、GSK-3β和TCF/LEF等）及胞質(zhì)蛋白β-catenin組成［14］。目前研究表明該信號通路在心血管疾病，尤其在AS中起著決定性作用［14-15］。有研究顯示，在AS的發(fā)展過程中，該通路可以通過激活炎癥導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、促進平滑肌細胞遷移和泡沫細胞形成、促進血管和瓣膜鈣化等途徑推動AS的發(fā)展［16］。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，人類頸動脈中破裂型斑塊中β-catenin的含量明顯高于穩(wěn)定型斑塊［17］，此外促炎細胞因子的表達水平明顯上升，表明Wnt/β-catenin信號通路在促炎反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［18］。

通心絡(luò)膠囊是以絡(luò)病理論為指導(dǎo)的臨床常用藥物，其主要成分包括人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸棗仁（炒）、冰片。在“絡(luò)以通為用”的治療原則指導(dǎo)下，通心絡(luò)膠囊被廣泛用于AS性心腦血管疾病。全方以人參為君藥，取其大補元氣、助氣血運行的功效；全蝎、水蛭為臣藥，二者共奏搜風通絡(luò)、活血止痙之效，君臣相合使絡(luò)脈通暢，氣血運行無阻；蟬蛻與蜈蚣助臣藥搜風止痙，赤芍涼血散血同時可制人參溫熱之性；降香、冰片味辛，能散能走，使絡(luò)脈條達，引藥入竅入絡(luò)；酸棗仁養(yǎng)血安神；全方具有益氣、活血、通絡(luò)止痛作用［19］。在本實驗中，我們通過高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型，以Wnt/β-catenin信號通路和炎癥水平為切入點，探討通心絡(luò)膠囊對AS的影響。研究結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組小鼠的斑塊面積較大，脂質(zhì)沉積明顯，內(nèi)膜增生嚴重，說明在經(jīng)過高脂喂養(yǎng)后已形成明顯的AS模型。同時模型組小鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白和炎癥因子表達增加，說明在AS發(fā)展過程中小鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路被激活，并對相關(guān)的炎癥因子進行調(diào)控。與模型組相比較，通心絡(luò)膠囊組小鼠粥樣硬化斑塊面積明顯下降，泡沫細胞堆積減少，內(nèi)膜增生減輕，同時Wnt/β-catenin信號通路上關(guān)鍵蛋白及炎癥因子表達水平明顯下降。這提示我們通心絡(luò)膠囊可能通過Wnt/β-catenin信號通路降低相關(guān)炎癥因子的表達，從而抑制動AS的發(fā)展。

綜上所述，本研究初步證實通心絡(luò)膠囊可以通過抑制Wnt/β-catenin通路降低相關(guān)炎癥因子的表達，從而抑制AS的發(fā)展。但是由于中藥具有多途徑、多靶點的特性，仍需進一步進行體內(nèi)外相關(guān)機制研究闡明具體機制。