辣蓼治療胃潰瘍作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

朱菲菲 趙雅媚 陳邦培 牛海艷 任守忠△

（1.海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102）

胃潰瘍是日常生活中最常見的消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制主要是致潰瘍因素與防御因素發(fā)生失衡有關(guān)［1］。吸煙、飲酒、幽門螺桿菌感染等是導(dǎo)致防御因素失衡的主要原因。目前，市場上治療胃潰瘍最常用的是質(zhì)子泵抑制藥和抑酸類藥物，療效明顯但復(fù)發(fā)率高且不良反應(yīng)多［2］。研究表明，中醫(yī)藥療法具有提高潰瘍愈合質(zhì)量，降低不良反應(yīng)，復(fù)發(fā)率低，療效顯著等優(yōu)勢［3］。辣蓼始載于《唐本草》，本品味辛，性溫，具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛和消腫解毒的功效，除傳統(tǒng)療效外，還具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗?jié)兒捅Ｗo(hù)胃黏膜損傷等作用［4］。目前對辣蓼治療胃潰瘍的作用機(jī)制研究也有報(bào)道，Ayaz等［5］研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼甲醇提取物對阿司匹林致大鼠胃潰瘍模型具有抗?jié)兒捅Ｗo(hù)胃黏膜的作用。劉洪梅等［6］證實(shí)，在乙醇致大鼠胃黏膜損傷前，使用楓蓼發(fā)酵提取液灌胃給藥，能抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕乙醇對胃黏膜細(xì)胞的損傷。但中藥發(fā)揮治療作用是多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)共同調(diào)節(jié)機(jī)體而產(chǎn)生的結(jié)果，這些單一通路研究難以全面闡明中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的協(xié)同作用機(jī)制。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥的分子機(jī)制研究中的應(yīng)用越來越多，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而預(yù)測中藥治療疾病的作用機(jī)制?；诖耍狙芯坎捎镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討辣蓼治療胃潰瘍的活性成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控通路，為辣蓼治療胃潰瘍的作用機(jī)制提供理論依據(jù)和新思路。

1 資料與方法

1.1 辣蓼活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 借助Web of Science、PubMed和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫收集辣蓼的化學(xué)成分，采用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），逐一檢索所有化學(xué)成分，篩選活性成分的標(biāo)準(zhǔn)為OB＞30%、DL＞0.18，得到有效成分及其潛在蛋白靶點(diǎn)。將蛋白靶點(diǎn)整理并刪除重復(fù)項(xiàng)后，使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），物種為Homo sapiens，將“靶點(diǎn)名稱”校正為“基因名稱”，即得到辣蓼活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 胃潰瘍作用靶點(diǎn)的篩選 以“Gastric ulcer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNet數(shù)據(jù)庫（https://www.Disgenet.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）中進(jìn)行檢索，獲取與胃潰瘍相關(guān)的作用靶點(diǎn)。整理并刪除重復(fù)作用靶點(diǎn)后，借助Venny2.1軟件將辣蓼活性成分的作用靶點(diǎn)與胃潰瘍相關(guān)的作用靶點(diǎn)繪制韋恩圖，取交集獲取辣蓼治療胃潰瘍的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 將“1.2”項(xiàng)下取得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）中，物種限定為“Homo sapiens”，將交互分?jǐn)?shù)設(shè)為最高置信度0.7，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，其余的參數(shù)設(shè)置保持不變，獲取相互作用關(guān)系結(jié)果。將結(jié)果以“tsv”文件格式導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2中，使用Network Analysis工具分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋮?shù)，并以degree值大于中位數(shù)的2倍篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析 將辣蓼-胃潰瘍的交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析，以顯著富集（P＜0.01）的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）的各前10個(gè)GO條目制作可視化柱狀圖并分析；以P＜0.01且基因富集程度排名前25位的通路繪制氣泡圖并分析。

1.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了科學(xué)解釋活性成分、靶點(diǎn)和通路的相互關(guān)系，將“1.4”項(xiàng)下收集到的與胃潰瘍相關(guān)的通路及其對應(yīng)的靶點(diǎn)，并找出靶點(diǎn)對應(yīng)的活性成分，用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)并采用Network Analysis工具對活性成分、靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系進(jìn)行可視化拓?fù)鋵W(xué)屬性分析。

2 結(jié)果

2.1 辣蓼活性成分及作用靶點(diǎn) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中共篩選出辣蓼活性成分13種，包括黃酮類、生物堿類和酚類等，這些物質(zhì)均具有良好的生物活性。此外，經(jīng)文獻(xiàn)挖掘，趙維中等［7-8］發(fā)現(xiàn)金絲桃苷通過抗氧化和促進(jìn)一氧化氮（NO）水平恢復(fù)對乙醇致小鼠胃黏膜損傷起到的保護(hù)作用和蘆丁對應(yīng)激性胃黏膜損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能與其抗氧化作用、鈣離子拮抗和改善GMBF有關(guān)。槲皮苷對NO、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)具有抑制作用［9］?；诖?，將這3個(gè)成分一并納入研究。最終，篩選出活性成分共有16種，并獲得183個(gè)相關(guān)作用靶點(diǎn)，見表1。

表1 辣蓼主要活性成分

2.2 辣蓼治療胃潰瘍的靶點(diǎn)預(yù)測 以“Gastric ulcer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，以Relevance score＞1為條件篩選得到4 227個(gè)靶點(diǎn)，DisGeNet數(shù)據(jù)庫中得到136個(gè)靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫中得到81個(gè)靶點(diǎn)。將以上3個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)合并整理去重后，最終獲得4 361個(gè)與胃潰瘍相關(guān)的作用靶點(diǎn)。將辣蓼活性成分的作用靶點(diǎn)與胃潰瘍的作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射取交集，最終獲得152個(gè)共同作用靶點(diǎn)，提示辣蓼可能通過這152個(gè)共同靶點(diǎn)發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。見圖1。

圖1 辣蓼與胃潰瘍的韋恩圖

2.3 PPI 辣蓼和胃潰瘍交集靶點(diǎn)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，共有143個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 009條邊；其中，節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中，以大于degree值中位數(shù)2倍以上即degree＞22的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，degree表示靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)連接的線的數(shù)目，degree越大，則節(jié)點(diǎn)越大且顏色越深，說明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中越重要。經(jīng)拓?fù)浞治隹芍?，辣蓼治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)共有Akt1、TNF、TP53、IL-6、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、EGFR、CASP3、RELA、VEGFA、MAPK1等29個(gè)。見圖2。

圖2 辣蓼與胃潰瘍共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析 借助DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)P＜0.01，共篩選得到472個(gè)GO條目。其中，共同靶點(diǎn)在生物過程（BP）富集了363個(gè)GO條目，主要涉及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對缺氧反應(yīng)的正調(diào)控、對L-抗壞血酸的反應(yīng)、DNA片段凋亡的正調(diào)控等過程；與細(xì)胞組成（CC）相關(guān)的條目有36個(gè)，主要涉及血小板α粒腔、膜筏、小窩、突觸前膜的組成部分等方面；與分子功能（MF）相關(guān)的條目有73個(gè)，主要涉及G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、雌激素2-羥化酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、藥物結(jié)合等方面。詳見圖3。

圖3 辣蓼治療胃潰瘍的GO功能富集圖

2.5 KEGG通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析，并得到共同靶點(diǎn)參與的通路有147條，以顯著富集即generation從大到小進(jìn)行排序并選取前25條繪制氣泡圖，詳見圖4。通過查閱文獻(xiàn)及分析圖4可知，PI3K/Akt、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、TNF、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路與胃潰瘍密切相關(guān)［10-14］，提示辣蓼有可能通過調(diào)控這幾個(gè)通路來治療胃潰瘍。

圖4 辣蓼治療胃潰瘍的KEGG通路富集分析

2.6 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 基于“2.5”項(xiàng)下與胃潰瘍最相關(guān)的6條通路構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖5。圖中藍(lán)色表示活性成分，綠色表示通路，粉色表示靶點(diǎn)；圖中共有91個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括9個(gè)成分，6個(gè)通路，76個(gè)靶點(diǎn)）和310條邊；度值越大，節(jié)點(diǎn)就越大，表明該成分、靶點(diǎn)或者通路在治療胃潰瘍中就越重要。圖中顯示，槲皮素、蘆丁、黃芩苷等度值排名靠前，可知這些成分有可能是治療胃潰瘍的主要活性成分；RELA、MAPK1、EGFR、IL-6、TNF、IL-6、IL-1β等靶點(diǎn)連接較多的活性成分和通路且與PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出的核心靶點(diǎn)幾乎一致。由此可知，辣蓼的活性成分可能通過這些關(guān)鍵靶點(diǎn)來調(diào)控PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、MAPK、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路達(dá)到治療胃潰瘍的效果。

圖5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

本研究經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到16種活性成分，度值排名靠前的包括蘆丁、槲皮素、黃芩苷等。研究表明，槲皮素通過降低胃黏膜細(xì)胞中活性氧的表達(dá)，進(jìn)而減少胃黏膜細(xì)胞損傷［15］。蘆丁據(jù)報(bào)道可減輕乙酸燒灼造成的大鼠胃潰瘍組織損傷［8］。羅桂香等［16］證實(shí)黃芩苷通過抑制血清中TNF-α的表達(dá)，降低胃黏膜炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。由成分-靶點(diǎn)-通路圖篩選出槲皮素、蘆丁、黃芩苷等是辣蓼治療胃潰瘍的關(guān)鍵成分，與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

在KEGG富集分析中，與辣蓼治療胃潰瘍最相關(guān)的通路有PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、MAPK、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路。PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要參與細(xì)胞增殖、分化，抑制細(xì)胞凋亡等方面。被上游通路激活后的PI3K將PIP2磷酸化為PIP3，促使PDK1與Akt結(jié)合并使其活化，活化后的Akt一方面通過對下游靶蛋白BAD磷酸化，使其與Bcl-2或Bcl-XL解離，從而保持Bcl-2或Bcl-XL抑制細(xì)胞凋亡的作用；另一方面，活化的Akt通過磷酸化P21/waf1/cip1蛋白加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期進(jìn)行細(xì)胞增殖；激活的PI3K/Akt信號通路通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡以達(dá)到修復(fù)胃黏膜損傷的作用［10］。TNF和IL-17信號通路均與炎癥反應(yīng)有關(guān)，TNF-α是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，主要參與炎癥反應(yīng)和免疫性疾病，TNF-α與其受體結(jié)合，觸發(fā)一系列炎癥因子的釋放，如IL-17、IL-8、IL-1β等，炎性細(xì)胞因子對胃黏膜的浸潤，導(dǎo)致胃潰瘍的形成及難以愈合且反復(fù)發(fā)作［17］。MAPK信號通路主要由4個(gè)部分組成：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5。其中，p38MAPK被炎癥因子、紫外線輻射、缺氧等誘導(dǎo)因素激活后，會(huì)促使各種促炎因子如TNF-α、IL-1的表達(dá)［18］。有研究表明，頭花蓼可通過抑制p38MAPK信號通路的磷酸化，阻斷其重要靶點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到抗幽門螺桿菌胃炎的作用［14］?；钚匝跏羌?xì)胞代謝的產(chǎn)物，其濃度高低決定了細(xì)胞內(nèi)部的氧化-抗氧化環(huán)境是否有利于細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。有研究表明，炎癥有益于活性氧和氮物質(zhì)的持續(xù)產(chǎn)生進(jìn)而形成致瘤性微環(huán)境，使細(xì)胞異常增殖［19］。此外，活性氧還可通過低價(jià)金屬離子的介導(dǎo)，使DNA的結(jié)構(gòu)和完整性遭到破壞，異?；虻某掷m(xù)積累并最終導(dǎo)致癌變［20］。Dahee Yeo等［21］研究證實(shí)，毛蒿水提物通過抑制促炎因子的產(chǎn)生和維持細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，從而對HCl/乙醇誘導(dǎo)的胃損傷產(chǎn)生胃保護(hù)作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出辣蓼治療胃潰瘍的16種活性成分，經(jīng)過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)可知，活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)對多個(gè)通路起調(diào)控作用以達(dá)到治療胃潰瘍的目的。但由于數(shù)據(jù)庫資源的不完整性，使得預(yù)測結(jié)果具有一定的局限性，因此，后期將會(huì)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證辣蓼治療胃潰瘍的作用機(jī)制。