嬰幼兒血管瘤異常表達基因分析*

何丹華，陳知英，陳國菊

(暨南大學附屬深圳市寶安區(qū)婦幼保健院皮膚美容科，廣東 深圳 518102)

嬰幼兒血管瘤(IH)是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，發(fā)病率為3%～10%[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，女性、高加索人、低體重早產(chǎn)兒、多胞胎、大齡嬰兒更易患病[2]。約10%的IH患兒在1年內(nèi)可自行緩解，而其余90%的IH患兒需3～10年或更長時間才能好轉(zhuǎn)[3]，部分患兒會留下瘢痕而影響美觀[4]，甚至造成永久性毀容。IH并發(fā)癥包括潰瘍、出血、視力障礙、氣道阻塞、充血性心力衰竭等，在某些情況下IH甚至可能導致死亡[5]。如能在IH早期積極干預、促進自發(fā)消退過程、減少血管瘤對周圍組織的侵襲則能改善患兒預后。因此，有必要深入探討IH的調(diào)控過程，以更好地理解IH的發(fā)病機制，對研發(fā)相關藥物具有重要意義。本研究采用生物信息學方法篩選IH的差異表達基因(DEGs)及其功能富集通路，篩選靶基因，旨在為后續(xù)研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1研究對象 2022年2月通過公開的GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索與IH相關文獻，獲取基因表達譜數(shù)據(jù)集(GSE127487)進行分析。該基因表達譜種屬為人類。樣本來源于皮膚組織。芯片平臺：GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。選取該數(shù)據(jù)集中IH患兒18例，健康對照組研究對象5例。

1.2方法

1.2.1DEGs的識別 通過R 4.1.0的GEOquery包從GEO數(shù)據(jù)庫中下載 GSE127487，去除一個探針對應多個分子的探針，當遇到對應同一個分子的探針時僅保留信號值最大的探針。然后通過箱式圖查看樣本標準化的情況，利用R語言limma軟件包進行IH組和健康對照組DEGs分析。統(tǒng)計學上顯著的DEGs定義為|logFC|≥2，P<0.05。

1.2.2DEGs功能和通路富集分析 采用WebGestalt[6](http：//www.webgestalt.org/)在線工具對DEGs進行功能富集分析，即生物過程、細胞成分、分子功能及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。

1.2.3構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(PPI) 通過在線分析工具STRING構(gòu)建PPI[7]。由Cytoscape軟件(3.8.1)對PPI進行可視化[8]。利用Cytohubba篩選構(gòu)成PPI穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的hub基因，通過MCC、NNC、Degree、EPC、BottleNeck 5種算法，挑選出排名前10的hub基因，然后通過在線工具InteractiVenn[9]取交集后得到hub基因，并將其用于后續(xù)研究。

1.2.4hub基因表達量分析 通過Graphpad prism 9分析hub基因表達差異，以箱式圖顯示。

1.2.5hub基因的診斷效能評估 通過R 4.1.0進行診斷效能評估，pROC包用于統(tǒng)計分析，ggplot2 進行可視化分析。最終繪制5個hub基因的受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1IH的DEGs GSE127487中有416個DEGs。其中350個基因表達上調(diào)，66個基因表達下調(diào)。見圖1。

注：A.火山圖；B.熱圖。

2.2基因本體(GO)和KEGG富集分析 416個DEGs均用WebGestalt在線工具進行分析。在生物過程中DEGs富集于血管發(fā)育、血管生成、心血管系統(tǒng)的發(fā)育、循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育、參與形態(tài)發(fā)生的解剖結(jié)構(gòu)形成等。在細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)形成、分子功能調(diào)控、生長因子結(jié)合、具有抗拉強度的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白二聚體活性等方面顯著富集。DEGs顯著富集于細胞的頂端部分、質(zhì)膜的固有成分、頂端質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、細胞外基質(zhì)。主要富集在白細胞跨內(nèi)皮的遷移、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、細胞外基質(zhì)受體相互作用等信號通路。見圖2。

2.3PPI構(gòu)建和hub基因篩選 共得到5個hub基因，分別為PECAM1、CD34、CDH5、TEK、THY1。見圖3、4。

圖3 PPI

2.4hub基因表達量 與健康對照組比較，IH組PECAM1、CD34、CDH5、TEK、THY1 mRNA表達均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A.GO分析；B.KEGG分析。

圖4 Cytohubba篩選5個核心基因編碼蛋白質(zhì)

注：A.PECAM1；B.CD34；C.CDH5；D.TEK；E.THY1。與健康對照組比較，aP<0.05。

2.5診斷效能 PECAM1、CD34、CDH5、TEK、THY1對IH均具有較好的診斷效能(ROC曲線下面積分別為1.000、0.991、1.000、0.965、0.965)。見圖6。

圖6 hub基因診斷IH的ROC曲線

3 討 論

IH是嬰幼兒最常見良性腫瘤之一，在正常情況下并不會出現(xiàn)，多在3～12個月內(nèi)快速生長，部分患兒在3～7年后自然消失。在新生兒中發(fā)病率為10%～12%，在早產(chǎn)兒中發(fā)病率為20%，以女嬰居多[10]。盡管對IH進行了大量的研究，但IH發(fā)生、發(fā)展機制尚不明確。目前，對IH的藥物及激光治療研究較多，但從分子水平研究血管瘤發(fā)生、發(fā)展的重要基因和途徑較少見。因此，IH的生物信息學研究對闡明其發(fā)病的分子機制具有重要參考意義。

本研究通過對IH的微陣列數(shù)據(jù)集進行差異表達分析，分別通過火山圖和熱圖展示了表達上調(diào)和下調(diào)的基因。對DEGs進行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，主要富集于血管發(fā)育、血管生成、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)形成、分子功能調(diào)控、生長因子結(jié)合等，主要參與白細胞跨內(nèi)皮的遷移、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、細胞外基質(zhì)受體相互作用等KEGG信號通路，符合血管瘤生長、發(fā)育過程。生物信息學方法能夠?qū)⑴c每例患兒相關的結(jié)果和模式與所有其他患兒的結(jié)果和模式聯(lián)系起來。通過生物信息學工具整合了來自分子、基因組和生物鏈接研究的數(shù)據(jù)。揭示了生物過程的復雜性和細節(jié)。這些生物系統(tǒng)的新概念將有助于理解和發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)病機制，設計高度準確的診斷方法，并開發(fā)新的治療和預防策略[11]。

本研究通過STRING在線工具及Cytoscape對DEGs進行PPI構(gòu)建及可視化，并且篩選了hub基因，結(jié)果顯示，THY1、TEK、CD34、CDH5、PECAM1在血管瘤患兒中其表達均明顯升高。由于是取多個結(jié)果交集找到的hub基因，因此，具有較高的準確性。本研究結(jié)果顯示，IH組hub基因表達明顯高于健康對照組，可作為IH的重要標志物。本研究判斷了hub基因的診斷效能，通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)，上述基因ROC曲線下面積均大于0.7，可見其具有較強的診斷效能。

PECAM1是一種跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白家族，在血小板、單核細胞、中性粒細胞表面表達。PECAM1分子通過所謂的嗜酸性連接相互結(jié)合，導致內(nèi)皮形成一種特定的保護屏障。PECAM1表達下調(diào)導致內(nèi)皮屏障完整性破壞和通透性增加，從而導致動脈內(nèi)膜炎癥過程的激活，影響血管粥樣硬化病變的形成和冠狀動脈疾病的發(fā)展。因此，PECAM1可能是IH的一種新的候選分子，為改善IH治療策略提供了新的視角。

CD34是一種高度糖基化的跨膜蛋白。首先在髓系白血病細胞系中被發(fā)現(xiàn)，抗CD34抗體的免疫組織學反應性也在非血淋巴腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括血管肉瘤、孤立性纖維性腫瘤、上皮樣肉瘤、梭形細胞脂肪瘤、隆突皮膚纖維肉瘤、肌成纖維細胞瘤等。因此，CD34可能被認為是IH的一種新的生物標志物。

CDH5定位于內(nèi)皮細胞的細胞間連接，在控制血管完整性和通透性方面發(fā)揮重要作用，并有助于內(nèi)皮細胞在管狀結(jié)構(gòu)中的整合[12-13]。CDH5是血管內(nèi)皮生長因子在內(nèi)皮細胞上的生存信號[14]。CDH5在腫瘤血管生成中也很重要，其在乳腺癌血管系統(tǒng)中表達上調(diào)，也被認為是乳腺癌的轉(zhuǎn)移標志物[15-16]。因此，CDH5可能是IH進展和靶向治療的重要分子。

TEK是酪氨酸激酶受體亞家族成員，主要表達于內(nèi)皮細胞中，是血管生成素配體ANGPT1、ANGPT2、ANGPT4的酪氨酸激酶受體[17]。TEK在調(diào)節(jié)血管生成、血管重塑、成熟和完整性方面發(fā)揮重要作用[18]。提示TEK可能參與了IH的發(fā)病機制，對TEK的進一步研究可能為開發(fā)治療IH及相關疾病的藥物提供了新靶點。

THY1也稱為CD90，是一種以糖基磷脂酰肌醇為基礎的糖蛋白，主要表達于血干細胞、活化的微血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞上，是胸腺細胞祖細胞的標志物。有研究發(fā)現(xiàn)，THY1能促進肝纖維化發(fā)展，是肝纖維化驅(qū)動基因[19]。THY1可能與IH的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

綜上所述，本研究通過對IH與正常樣本的DEGs進行一系列生物信息學分析，找出了一些與IH密切相關的候選基因和通路調(diào)控網(wǎng)絡。結(jié)果提示，PECAM1、CD34、CDH5、TEK、THY1參與了IH的發(fā)病過程，有望成為IH診治的靶點，為進一步診治IH提供了依據(jù)。然而，本研究的局限性是缺乏實驗驗證。這些通過生物信息學分析得到的預測結(jié)果還需要實時熒光定量-聚合酶鏈反應和免疫印跡試驗等實驗研究進一步證實。