高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蜈蚣藥材中5種成分含量

馬云， 馬慶文， 范建偉， 李倩， 申鳳霞， 關(guān)永霞， 張貴民

(1.魯南厚普制藥有限公司， 臨沂 276006； 2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 臨沂 276006； 3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司， 臨沂 276006)

蜈蚣最開(kāi)始記載于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥經(jīng)典《神農(nóng)本草經(jīng)》，在中國(guó)有兩千多年的藥用歷史，是臨床上不可或缺的傳統(tǒng)中藥材[1]?！吨袊?guó)藥典》中規(guī)定蜈蚣藥材為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥蟲(chóng)體，其主要功效為息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)，現(xiàn)代藥理研究表明蜈蚣有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗凝血、抗驚厥、抗凝纖溶、調(diào)節(jié)免疫、降壓降脂等藥理作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可用于治療多種外科炎癥、惡性腫瘤、糖尿病、癲癇、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種神經(jīng)疼痛、血管栓塞性疾病，還可治療百日咳、神經(jīng)頭痛、結(jié)核病等疾病[2-4]。眾所周知，動(dòng)物類(lèi)藥材有效物質(zhì)基礎(chǔ)不太明確，蜈蚣藥材的研究同樣難以避免此難題[5]?，F(xiàn)行《中國(guó)藥典》中對(duì)蜈蚣藥材的質(zhì)量控制方法較為簡(jiǎn)單，僅從性狀、浸出物等方面對(duì)其進(jìn)行鑒別評(píng)估，難以對(duì)藥用蜈蚣藥材質(zhì)量進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，對(duì)蜈蚣藥材開(kāi)展多手段、多指標(biāo)的質(zhì)量控制方法研究，有利于完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，保障藥材質(zhì)量和臨床用藥的安全有效[6]?；瘜W(xué)成分是中藥材起效的物質(zhì)基礎(chǔ)，從化學(xué)分子層面對(duì)蜈蚣藥材展開(kāi)多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，有利于完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，更好地實(shí)現(xiàn)并保障中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)為臨床療效服務(wù)的最終目的[7]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，尚未有蜈蚣藥材多成分含量同時(shí)測(cè)定且基于含量測(cè)定對(duì)蜈蚣藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的相關(guān)研究，核苷類(lèi)成分是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成物質(zhì)，在動(dòng)物、植物和微生物等生物中廣泛存在，具有多種生理功能和藥理活性[8]。如張琪等[9]發(fā)現(xiàn)蜈蚣中含有次黃嘌呤和黃嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤具有抗腫瘤作用；3，8-二羥基喹啉對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制及促凋亡的作用，能顯著抑制腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和侵襲遷移的作用[10-11]；課題組從蜈蚣中分離得到硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉[12]；因此將次黃嘌呤、黃嘌呤、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),旨在為蜈蚣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性研究以及動(dòng)物藥中有效成分定性、定量分析提供參考?，F(xiàn)通過(guò)高效液相色譜法建立蜈蚣中5種成分的含量測(cè)定方法，以期為蜈蚣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性研究以及動(dòng)物藥中有效成分定性、定量分析提供參考。

1 材料

1.1 試劑

乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，異丙醇、磷酸(色譜純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)，甲醇(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；有機(jī)濾頭(0.22 μm孔徑，愛(ài)西默科技有限公司)。

次黃嘌呤(6-hydroxypurine，CAS：68-94-0，純度≥98%)，黃嘌呤(2,6-dihydroxypurine，CAS：69-89-6，純度≥98%)，以上對(duì)照品由上海源葉生物科技有限公司提供；硫酸-3-羥基喹啉(jineol-8-sulfate，純度≥98%)，硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉(3-hydroxy-4-methoxyquinolin-8-yl hydrogen sulfate，純度≥97%)，3,8-二羥基喹啉(jineol，純度≥98%)，以上對(duì)照品為自制品。

1.2 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、AgilentOpen Lab色譜工作站，安捷倫科技有限公司)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(TOLEDO LE204E，METTLER)；萬(wàn)分之一電子分析天平(01193-YP601N，METTLER)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；純水/超純水系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)材料

蜈蚣藥材由魯南厚普制藥有限公司提供，蜈蚣藥材共計(jì)14批，經(jīng)魯南制藥集團(tuán)高級(jí)工程師范建偉鑒定，均為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL. Koch的干燥全體，憑證標(biāo)本存放于魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。樣品具體信息如表1所示。

表1 樣品信息表(n=14)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備

取蜈蚣藥材適量，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)4號(hào)篩，作為供試樣品，備用。取樣品粉末2 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱(chēng)重，回流30 min，放冷至室溫，再稱(chēng)重，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，離心(4 500 r/min，5 min)，吸取上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾頭，棄去初濾液，以續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉各適量，分別用純甲醇溶解并制成濃度分別為0.131 1、0.381 0、0.331 6、0.274 8、0.298 0 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液，備用。取上述對(duì)照品貯備液適量體積，稀釋成次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉 0.065 55、0.038 1、0.041 45、0.010 992、0.029 8 mg/mL的溶液，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：10 mmol/LKH2PO4溶液，流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.8 mL/min；溶劑：甲醇-超純水(50∶50)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；梯度洗脫(0～15 min，0%B；15～40 min，0%B變至20%B；40～60 min，20%B；60～65 min，20%B變至0%B)，理論塔板數(shù)按次黃嘌呤計(jì)算不得低于5 000。蜈蚣藥材高效液相色譜圖如圖1所示。

1為次黃嘌呤；2為黃嘌呤；3為硫酸-3-羥基喹啉；4為硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉；5為3,8-二羥基喹啉圖1 高效液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性范圍考察

分別取上述混合對(duì)照品溶液不同體積，按照2.2節(jié)色譜方法進(jìn)樣，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，5種活性成分線(xiàn)性回歸方程如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，次黃嘌呤、黃嘌呤、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉在各自相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 5種活性成分線(xiàn)性方程

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按照2.2節(jié)色譜方法進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。得到次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉平均峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)見(jiàn)表3，5種成分的RSD均小于1.0%，表明本色譜方法系統(tǒng)適用，儀器精密穩(wěn)定。

表3 5種活性成分精密度試驗(yàn)(n=6)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取蜈蚣藥材粉末6次，按照2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照2.2節(jié)的色譜方法分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。各組分6次含量平均值的RSD均小于1.0%，表明蜈蚣藥材活性成分含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

表4 5種活性成分重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取蜈蚣藥材供試樣品，按照2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h分別按照2.2節(jié)的色譜方法進(jìn)樣，記錄峰面積。得到次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉平均峰面積并計(jì)算RSD，4種成分的RSD均小于2.0%，表明蜈蚣藥材供試樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表5。

表5 5種活性成分穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的蜈蚣藥材樣品粉末6份，分別準(zhǔn)確加入含有等量各組分對(duì)照品的對(duì)照品，按2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按照2.2節(jié)的色譜方法進(jìn)樣，所得結(jié)果如表6所示。結(jié)果顯示，各組分平均回收率的RSD均小于4.0%，說(shuō)明兩個(gè)含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度良好?；厥章实挠?jì)算公式為

(1)

表6 5種活性成分回收率試驗(yàn)(n=6)

式(1)中：R為回收率；md為測(cè)得質(zhì)量；ms為樣品中所含被測(cè)成分質(zhì)量；mc為加入的對(duì)照品質(zhì)量。

2.4 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蜈蚣藥材中5種成分含量

2.4.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算

(1)斜率校正法。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式為

(2)

式(2)中：X為進(jìn)樣濃度；Y為峰面積；a為線(xiàn)性方程斜率；b為線(xiàn)性方程截距。

(3)

式(3)中：fk/s為校正因子；as為內(nèi)參物s的線(xiàn)性方程斜率；ak為待測(cè)成分k線(xiàn)性方程斜率。

待測(cè)成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式為

(4)

式(4)中：Ck′為待測(cè)成分濃度；Ak′為待測(cè)成分峰面積；fk/s為校正因子；as為內(nèi)參物斜率。

應(yīng)用斜率校正法進(jìn)行計(jì)算，得到其他成分相對(duì)于次黃嘌呤的fk/s，黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉相對(duì)于次黃嘌呤的fk/s見(jiàn)表7。

表7 斜率校正法校正因子

(2)多點(diǎn)校正法。以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fk/s取平均值做定量用fk/s。校正因子計(jì)算公式為

fk/s=(ASCK)/(AkCs)

(5)

待測(cè)成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式為

Ck′=(fk/sCsAk′)/AS

(6)

式中：AS為參照物質(zhì)色譜峰峰面積；Cs為參照物質(zhì)量濃度；AK為其他對(duì)照組分色譜峰峰面積；Ck為其他對(duì)照組分質(zhì)量濃度；Ak為待測(cè)組分色譜峰峰面積。計(jì)算結(jié)果如表8所示。

表8 多點(diǎn)校正法校正因子(n=5)

2.4.2 相對(duì)保留值的計(jì)算

利用相對(duì)保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行定位，即以各待測(cè)組分的色譜峰與次黃嘌呤色譜峰的保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行確定。相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算公式為

RRT=Tk/Ts

(7)

式(7)中：Ts為參照物保留時(shí)間；Tk為其他待測(cè)組分保留時(shí)間。計(jì)算結(jié)果如表9所示。

表9 多點(diǎn)校正法相對(duì)保留值(n=5)

2.5 一測(cè)多評(píng)方法在蜈蚣藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

2.5.1 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較

取14批蜈蚣藥材供試樣品按照2.1節(jié)的制備對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.2節(jié)的色譜條件進(jìn)樣，并分別通過(guò)一測(cè)多評(píng)方法與外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，并比較兩種測(cè)定方法的結(jié)果，見(jiàn)表10。由表10可知，不同計(jì)算方法得到的4種活性成分含量RSD均小于3%，適用性良好。

表10 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果(n=14)

2.5.2 多點(diǎn)校正相對(duì)保留值與外標(biāo)實(shí)際保留時(shí)間比較

將14批蜈蚣藥材供試品通過(guò)多點(diǎn)校正因子計(jì)算的理論保留時(shí)間與外標(biāo)法的實(shí)際保留時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果無(wú)顯著差異，見(jiàn)表11，5種活性成分計(jì)算保留值與實(shí)際保留值之間RSD均小于1.0%。

表11 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法保留時(shí)間比較(n=14)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件確定

動(dòng)物藥材藥效成分尚未清晰，蜈蚣藥材中，次黃嘌呤出峰時(shí)間穩(wěn)定，價(jià)值相對(duì)于其他成分較低，所以將次黃嘌呤確定為內(nèi)參物。試驗(yàn)過(guò)程中，分別考察提取溶劑70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇等；稱(chēng)樣量1.5、2.0、2.5 g；溶劑體積25、50、100 mL；回流處理時(shí)間20、30、40 min；當(dāng)提取方法為：稱(chēng)樣量2.0 g、溶劑體積50 mL、提取溶劑50%甲醇、回流處理時(shí)間30 min時(shí)，色譜圖峰面積表現(xiàn)最好，所有優(yōu)選出的提取方法為：精密稱(chēng)取2.0 g供試品粉末、加入50 mL50%甲醇溶液、回流處理30 min。測(cè)定方法共檢測(cè)蜈蚣藥材中5種活性成分的含量。通過(guò)對(duì)蜈蚣藥材中5種活性成分的全波長(zhǎng)掃描，對(duì)比5種成分的最大吸收波長(zhǎng)，綜合考慮，將色譜方法的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為254 nm。對(duì)相同色譜條件不同柱溫下出峰時(shí)間及含量測(cè)定準(zhǔn)確度進(jìn)行考察，分別考察了25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)在30 ℃條件下，各色譜峰分離度達(dá)標(biāo)，出峰時(shí)間適當(dāng)。通過(guò)兩種方法進(jìn)行了校正因子的計(jì)算，分別為斜率校正法與多點(diǎn)校正法，斜率校正法僅通過(guò)各成分線(xiàn)性范圍內(nèi)的斜率進(jìn)行計(jì)算，為將方程偏差考慮在內(nèi)，綜合實(shí)際，此方法計(jì)算得成分含量存在較大誤差；而多點(diǎn)校正法為通過(guò)實(shí)際不同進(jìn)樣濃度的峰面積與濃度數(shù)值進(jìn)行計(jì)算得到校正因子，在校正因子驗(yàn)證部分，發(fā)現(xiàn)此方法得到的校正因子計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法無(wú)顯著差異，因此選擇多點(diǎn)校正法計(jì)算得到的校正因子。

3.2 結(jié)論

采用HPLC將多成分含量測(cè)定方法與一測(cè)多評(píng)相結(jié)合，建立的以次黃嘌呤為內(nèi)參物一測(cè)多評(píng)定量分析方法用于蜈蚣藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，蜈蚣藥材內(nèi)容物中4種活性成分相對(duì)于內(nèi)參物的校正因子(fk/s)分別為1.67、9.01、5.03、0.76，相對(duì)保留值(RRT)分別為1.22、2.65、3.04、3.52。在14批蜈蚣藥材供試品中，外標(biāo)法與QAMS法含量測(cè)定結(jié)果比較，兩者無(wú)顯著差異，表明QAMS測(cè)定結(jié)果可靠。所建立的一測(cè)多評(píng)方法具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷、成本低等特點(diǎn)，較全面地反映蜈蚣藥材的內(nèi)在質(zhì)量，檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間均大幅降低，適用于蜈蚣藥材優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立，有利于進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物藥材的質(zhì)量控制水平。