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    高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蜈蚣藥材中5種成分含量

    2023-02-11 09:49:12馬云馬慶文范建偉李倩申鳳霞關(guān)永霞張貴民
    科學(xué)技術(shù)與工程 2023年1期
    關(guān)鍵詞:次黃嘌呤蜈蚣喹啉

    馬云, 馬慶文, 范建偉, 李倩, 申鳳霞, 關(guān)永霞, 張貴民

    (1.魯南厚普制藥有限公司, 臨沂 276006; 2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 臨沂 276006; 3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司, 臨沂 276006)

    蜈蚣最開(kāi)始記載于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥經(jīng)典《神農(nóng)本草經(jīng)》,在中國(guó)有兩千多年的藥用歷史,是臨床上不可或缺的傳統(tǒng)中藥材[1]?!吨袊?guó)藥典》中規(guī)定蜈蚣藥材為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥蟲(chóng)體,其主要功效為息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié),現(xiàn)代藥理研究表明蜈蚣有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗凝血、抗驚厥、抗凝纖溶、調(diào)節(jié)免疫、降壓降脂等藥理作用,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可用于治療多種外科炎癥、惡性腫瘤、糖尿病、癲癇、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種神經(jīng)疼痛、血管栓塞性疾病,還可治療百日咳、神經(jīng)頭痛、結(jié)核病等疾病[2-4]。眾所周知,動(dòng)物類(lèi)藥材有效物質(zhì)基礎(chǔ)不太明確,蜈蚣藥材的研究同樣難以避免此難題[5]?,F(xiàn)行《中國(guó)藥典》中對(duì)蜈蚣藥材的質(zhì)量控制方法較為簡(jiǎn)單,僅從性狀、浸出物等方面對(duì)其進(jìn)行鑒別評(píng)估,難以對(duì)藥用蜈蚣藥材質(zhì)量進(jìn)行有效評(píng)價(jià),對(duì)蜈蚣藥材開(kāi)展多手段、多指標(biāo)的質(zhì)量控制方法研究,有利于完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系,保障藥材質(zhì)量和臨床用藥的安全有效[6]?;瘜W(xué)成分是中藥材起效的物質(zhì)基礎(chǔ),從化學(xué)分子層面對(duì)蜈蚣藥材展開(kāi)多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究,有利于完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系,更好地實(shí)現(xiàn)并保障中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)為臨床療效服務(wù)的最終目的[7]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研,尚未有蜈蚣藥材多成分含量同時(shí)測(cè)定且基于含量測(cè)定對(duì)蜈蚣藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的相關(guān)研究,核苷類(lèi)成分是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成物質(zhì),在動(dòng)物、植物和微生物等生物中廣泛存在,具有多種生理功能和藥理活性[8]。如張琪等[9]發(fā)現(xiàn)蜈蚣中含有次黃嘌呤和黃嘌呤,次黃嘌呤和黃嘌呤具有抗腫瘤作用;3,8-二羥基喹啉對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制及促凋亡的作用,能顯著抑制腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和侵襲遷移的作用[10-11];課題組從蜈蚣中分離得到硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉[12];因此將次黃嘌呤、黃嘌呤、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),旨在為蜈蚣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性研究以及動(dòng)物藥中有效成分定性、定量分析提供參考?,F(xiàn)通過(guò)高效液相色譜法建立蜈蚣中5種成分的含量測(cè)定方法,以期為蜈蚣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性研究以及動(dòng)物藥中有效成分定性、定量分析提供參考。

    1 材料

    1.1 試劑

    乙腈、甲醇(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司),異丙醇、磷酸(色譜純,南京化學(xué)試劑股份有限公司),甲醇(分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司);有機(jī)濾頭(0.22 μm孔徑,愛(ài)西默科技有限公司)。

    次黃嘌呤(6-hydroxypurine,CAS:68-94-0,純度≥98%),黃嘌呤(2,6-dihydroxypurine,CAS:69-89-6,純度≥98%),以上對(duì)照品由上海源葉生物科技有限公司提供;硫酸-3-羥基喹啉(jineol-8-sulfate,純度≥98%),硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉(3-hydroxy-4-methoxyquinolin-8-yl hydrogen sulfate,純度≥97%),3,8-二羥基喹啉(jineol,純度≥98%),以上對(duì)照品為自制品。

    1.2 儀器

    Agilent 1100高效液相色譜儀(包括DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、AgilentOpen Lab色譜工作站,安捷倫科技有限公司);十萬(wàn)分之一電子分析天平(TOLEDO LE204E,METTLER);萬(wàn)分之一電子分析天平(01193-YP601N,METTLER);數(shù)控超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司);純水/超純水系統(tǒng)。

    1.3 試驗(yàn)材料

    蜈蚣藥材由魯南厚普制藥有限公司提供,蜈蚣藥材共計(jì)14批,經(jīng)魯南制藥集團(tuán)高級(jí)工程師范建偉鑒定,均為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL. Koch的干燥全體,憑證標(biāo)本存放于魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。樣品具體信息如表1所示。

    表1 樣品信息表(n=14)

    2 方法與結(jié)果

    2.1 溶液制備

    2.1.1 供試品溶液制備

    取蜈蚣藥材適量,粉碎機(jī)粉碎,過(guò)4號(hào)篩,作為供試樣品,備用。取樣品粉末2 g,精密稱(chēng)定,置于100 mL圓底燒瓶中,精密加入50%甲醇溶液50 mL,密塞,稱(chēng)重,回流30 min,放冷至室溫,再稱(chēng)重,用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量,搖勻,離心(4 500 r/min,5 min),吸取上清液,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾頭,棄去初濾液,以續(xù)濾液作為供試品溶液。

    2.1.2 對(duì)照品溶液制備

    精密稱(chēng)取次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉各適量,分別用純甲醇溶解并制成濃度分別為0.131 1、0.381 0、0.331 6、0.274 8、0.298 0 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液,備用。取上述對(duì)照品貯備液適量體積,稀釋成次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉 0.065 55、0.038 1、0.041 45、0.010 992、0.029 8 mg/mL的溶液,即為混合對(duì)照品溶液。

    2.2 色譜條件

    色譜柱:YMC-Pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:10 mmol/LKH2PO4溶液,流動(dòng)相B:乙腈;流速:0.8 mL/min;溶劑:甲醇-超純水(50∶50);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;梯度洗脫(0~15 min,0%B;15~40 min,0%B變至20%B;40~60 min,20%B;60~65 min,20%B變至0%B),理論塔板數(shù)按次黃嘌呤計(jì)算不得低于5 000。蜈蚣藥材高效液相色譜圖如圖1所示。

    1為次黃嘌呤;2為黃嘌呤;3為硫酸-3-羥基喹啉;4為硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉;5為3,8-二羥基喹啉圖1 高效液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 線(xiàn)性范圍考察

    分別取上述混合對(duì)照品溶液不同體積,按照2.2節(jié)色譜方法進(jìn)樣,以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),計(jì)算回歸方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),5種活性成分線(xiàn)性回歸方程如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明,次黃嘌呤、黃嘌呤、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉、3,8-二羥基喹啉在各自相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

    表2 5種活性成分線(xiàn)性方程

    2.3.2 精密度試驗(yàn)

    取混合對(duì)照品溶液,按照2.2節(jié)色譜方法進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。得到次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉平均峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)見(jiàn)表3,5種成分的RSD均小于1.0%,表明本色譜方法系統(tǒng)適用,儀器精密穩(wěn)定。

    表3 5種活性成分精密度試驗(yàn)(n=6)

    2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取蜈蚣藥材粉末6次,按照2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備供試品溶液,按照2.2節(jié)的色譜方法分別進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算成分含量,結(jié)果見(jiàn)表4。各組分6次含量平均值的RSD均小于1.0%,表明蜈蚣藥材活性成分含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

    表4 5種活性成分重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)

    2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取蜈蚣藥材供試樣品,按照2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備供試品溶液,于0、2、4、6、8、12、24、48 h分別按照2.2節(jié)的色譜方法進(jìn)樣,記錄峰面積。得到次黃嘌呤、黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉平均峰面積并計(jì)算RSD,4種成分的RSD均小于2.0%,表明蜈蚣藥材供試樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定,見(jiàn)表5。

    表5 5種活性成分穩(wěn)定性試驗(yàn)

    2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取已知含量的蜈蚣藥材樣品粉末6份,分別準(zhǔn)確加入含有等量各組分對(duì)照品的對(duì)照品,按2.1節(jié)的供試品溶液制備方法制備樣品溶液,按照2.2節(jié)的色譜方法進(jìn)樣,所得結(jié)果如表6所示。結(jié)果顯示,各組分平均回收率的RSD均小于4.0%,說(shuō)明兩個(gè)含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度良好?;厥章实挠?jì)算公式為

    (1)

    表6 5種活性成分回收率試驗(yàn)(n=6)

    式(1)中:R為回收率;md為測(cè)得質(zhì)量;ms為樣品中所含被測(cè)成分質(zhì)量;mc為加入的對(duì)照品質(zhì)量。

    2.4 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蜈蚣藥材中5種成分含量

    2.4.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算

    (1)斜率校正法。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式為

    (2)

    式(2)中:X為進(jìn)樣濃度;Y為峰面積;a為線(xiàn)性方程斜率;b為線(xiàn)性方程截距。

    (3)

    式(3)中:fk/s為校正因子;as為內(nèi)參物s的線(xiàn)性方程斜率;ak為待測(cè)成分k線(xiàn)性方程斜率。

    待測(cè)成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式為

    (4)

    式(4)中:Ck′為待測(cè)成分濃度;Ak′為待測(cè)成分峰面積;fk/s為校正因子;as為內(nèi)參物斜率。

    應(yīng)用斜率校正法進(jìn)行計(jì)算,得到其他成分相對(duì)于次黃嘌呤的fk/s,黃嘌呤、3,8-二羥基喹啉、硫酸-3-羥基喹啉、硫酸-3-羥基-4-甲氧基喹啉相對(duì)于次黃嘌呤的fk/s見(jiàn)表7。

    表7 斜率校正法校正因子

    (2)多點(diǎn)校正法。以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fk/s取平均值做定量用fk/s。校正因子計(jì)算公式為

    fk/s=(ASCK)/(AkCs)

    (5)

    待測(cè)成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式為

    Ck′=(fk/sCsAk′)/AS

    (6)

    式中:AS為參照物質(zhì)色譜峰峰面積;Cs為參照物質(zhì)量濃度;AK為其他對(duì)照組分色譜峰峰面積;Ck為其他對(duì)照組分質(zhì)量濃度;Ak為待測(cè)組分色譜峰峰面積。計(jì)算結(jié)果如表8所示。

    表8 多點(diǎn)校正法校正因子(n=5)

    2.4.2 相對(duì)保留值的計(jì)算

    利用相對(duì)保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行定位,即以各待測(cè)組分的色譜峰與次黃嘌呤色譜峰的保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行確定。相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算公式為

    RRT=Tk/Ts

    (7)

    式(7)中:Ts為參照物保留時(shí)間;Tk為其他待測(cè)組分保留時(shí)間。計(jì)算結(jié)果如表9所示。

    表9 多點(diǎn)校正法相對(duì)保留值(n=5)

    2.5 一測(cè)多評(píng)方法在蜈蚣藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

    2.5.1 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較

    取14批蜈蚣藥材供試樣品按照2.1節(jié)的制備對(duì)照品溶液、供試品溶液,按2.2節(jié)的色譜條件進(jìn)樣,并分別通過(guò)一測(cè)多評(píng)方法與外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定,并比較兩種測(cè)定方法的結(jié)果,見(jiàn)表10。由表10可知,不同計(jì)算方法得到的4種活性成分含量RSD均小于3%,適用性良好。

    表10 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果(n=14)

    2.5.2 多點(diǎn)校正相對(duì)保留值與外標(biāo)實(shí)際保留時(shí)間比較

    將14批蜈蚣藥材供試品通過(guò)多點(diǎn)校正因子計(jì)算的理論保留時(shí)間與外標(biāo)法的實(shí)際保留時(shí)間進(jìn)行比較,結(jié)果無(wú)顯著差異,見(jiàn)表11,5種活性成分計(jì)算保留值與實(shí)際保留值之間RSD均小于1.0%。

    表11 一測(cè)多評(píng)結(jié)果與外標(biāo)法保留時(shí)間比較(n=14)

    3 討論與結(jié)論

    3.1 色譜條件確定

    動(dòng)物藥材藥效成分尚未清晰,蜈蚣藥材中,次黃嘌呤出峰時(shí)間穩(wěn)定,價(jià)值相對(duì)于其他成分較低,所以將次黃嘌呤確定為內(nèi)參物。試驗(yàn)過(guò)程中,分別考察提取溶劑70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇等;稱(chēng)樣量1.5、2.0、2.5 g;溶劑體積25、50、100 mL;回流處理時(shí)間20、30、40 min;當(dāng)提取方法為:稱(chēng)樣量2.0 g、溶劑體積50 mL、提取溶劑50%甲醇、回流處理時(shí)間30 min時(shí),色譜圖峰面積表現(xiàn)最好,所有優(yōu)選出的提取方法為:精密稱(chēng)取2.0 g供試品粉末、加入50 mL50%甲醇溶液、回流處理30 min。測(cè)定方法共檢測(cè)蜈蚣藥材中5種活性成分的含量。通過(guò)對(duì)蜈蚣藥材中5種活性成分的全波長(zhǎng)掃描,對(duì)比5種成分的最大吸收波長(zhǎng),綜合考慮,將色譜方法的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為254 nm。對(duì)相同色譜條件不同柱溫下出峰時(shí)間及含量測(cè)定準(zhǔn)確度進(jìn)行考察,分別考察了25、30、35 ℃,發(fā)現(xiàn)在30 ℃條件下,各色譜峰分離度達(dá)標(biāo),出峰時(shí)間適當(dāng)。通過(guò)兩種方法進(jìn)行了校正因子的計(jì)算,分別為斜率校正法與多點(diǎn)校正法,斜率校正法僅通過(guò)各成分線(xiàn)性范圍內(nèi)的斜率進(jìn)行計(jì)算,為將方程偏差考慮在內(nèi),綜合實(shí)際,此方法計(jì)算得成分含量存在較大誤差;而多點(diǎn)校正法為通過(guò)實(shí)際不同進(jìn)樣濃度的峰面積與濃度數(shù)值進(jìn)行計(jì)算得到校正因子,在校正因子驗(yàn)證部分,發(fā)現(xiàn)此方法得到的校正因子計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法無(wú)顯著差異,因此選擇多點(diǎn)校正法計(jì)算得到的校正因子。

    3.2 結(jié)論

    采用HPLC將多成分含量測(cè)定方法與一測(cè)多評(píng)相結(jié)合,建立的以次黃嘌呤為內(nèi)參物一測(cè)多評(píng)定量分析方法用于蜈蚣藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià),蜈蚣藥材內(nèi)容物中4種活性成分相對(duì)于內(nèi)參物的校正因子(fk/s)分別為1.67、9.01、5.03、0.76,相對(duì)保留值(RRT)分別為1.22、2.65、3.04、3.52。在14批蜈蚣藥材供試品中,外標(biāo)法與QAMS法含量測(cè)定結(jié)果比較,兩者無(wú)顯著差異,表明QAMS測(cè)定結(jié)果可靠。所建立的一測(cè)多評(píng)方法具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷、成本低等特點(diǎn),較全面地反映蜈蚣藥材的內(nèi)在質(zhì)量,檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間均大幅降低,適用于蜈蚣藥材優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立,有利于進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物藥材的質(zhì)量控制水平。

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