肺炎克雷伯菌的喹諾酮類耐藥株gyrA 基因研究

郭麗娜 王家欣 姚文 劉琦琦

目前,用于治療由肺炎克雷伯菌所致感染的抗菌藥物包括碳青霉烯類、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類等。其中,喹諾酮類抗菌藥物具有抗菌譜廣、抗菌作用強、生物利用度高、組織滲透性好、不良反應(yīng)較少等優(yōu)點,受到臨床重視。然而隨著喹諾酮類藥物的廣泛應(yīng)用,耐喹諾酮類肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)已非常普遍［1,2］,有資料顯示肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物耐藥主要是由DNA 回旋酶的A 亞基的gyrA 基因突變引起變異［3］,且存在地域差異［4］。為了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制,共收集43 株耐喹諾酮類藥物的臨床菌株,采用PCR 檢測gyrA 基因,擴增產(chǎn)物純化后測序,進而探討其相關(guān)耐藥機制。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2017 年1 月～2018 年12 月期間臨床樣本分離的肺炎克雷伯菌的喹諾酮類耐藥株43 株,其中痰液21 份,尿液6 份,靜脈血5 份,穿刺液5 份,膽汁4 份,腹水2 份。標本留取規(guī)范,送檢及時,剔除不符合送檢標準者(痰標本涂片鏡檢應(yīng)符合：白細胞>25/LP,上皮細胞<10/LP),結(jié)合涂片和培養(yǎng)結(jié)果,剔除污染菌。菌株均經(jīng)Phoenix 100 全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定,鑒定相似度>99%。

1.2儀器與試劑 Phoenix 100 全自動細菌鑒定系統(tǒng)(美國BD 公司)；引物及測序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成；PCR 擴增試劑及瓊脂糖購自北京瀚?？堤┽t(yī)藥科技有限公司；Eppendorf PCR 儀；凝膠成像儀［上海勤翔(Clinx)］；OMEGA 切膠純化試劑盒。

1.3藥敏試驗 采用Phoenix 100 革蘭氏陰性細菌藥敏板進行藥敏試驗,試驗結(jié)果判斷參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinicai and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)標準。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC 27853,標準菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.4基因檢測模板制備 采用堿裂解液法,將1.5 ml 37℃過夜純培養(yǎng)的細菌于4℃ 10000 r/min 離心2 min,收集菌體,重懸于500 μl dd H2O 溶液中,95℃水浴20 min 后,4℃10000 r/min 離心5 min,保留上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5PCR 檢測gyrA 基因 PCR 擴增體系：模板1.5 μl,上游和下游引物各1 μl,Primer STAR Max 25 μl,dd H2O 21.5 μl,共50 μl。PCR 擴增程序為：95℃預變性5 min,接著95℃30 s →58℃30 s →72℃45 s,共35 個循環(huán),最后72℃延長5 min。按照OMEGA 切膠純化試劑盒說明書進行PCR 產(chǎn)物純化。純化后的產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進行測序,測序結(jié)果與肺炎克雷伯菌的標準gyrA 基因序列進行比對。本文PCR 檢測所用的引物序列見表1。

表1 PCR 檢測所用引物序列

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌gyrA 基因PCR 檢測結(jié)果 43 株肺炎克雷伯菌gyrA 基因的PCR 擴增均得到目的片段,擴增產(chǎn)物長度為441 bp,與文獻［5］報道一致。部分菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的電泳圖及gyrA 基因擴增結(jié)果見圖1。

圖1 部分菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的電泳圖及gyrA 基因擴增結(jié)果圖

2.2肺炎克雷伯菌gyrA 基因測序結(jié)果 所檢測的喹諾酮類耐藥株的gyrA 基因序列與肺炎克雷伯菌標準gyrA 基因序列進行比對,其基因突變情況見表2。

表2 gyrA 基因突變比對結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科重要的細菌之一,常引起醫(yī)院和社區(qū)感染,且檢出率呈逐年上升的趨勢［6］,可引起肺炎、泌尿系感染、菌血癥、手術(shù)切口及其他部位感染［7］。近年來有研究表明：喹諾酮類藥物在臨床上被廣泛使用,肺炎克雷伯菌對這類藥物耐藥率呈逐年升高趨勢［8-10］。

喹諾酮類藥物作用的靶位是細菌的DNA 回旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ,DNA 回旋酶在DNA 復制,轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用,可使松弛的DNA 鏈形成超螺旋結(jié)構(gòu),此酶是由2 個gyrA 基因編碼的gyrA 亞基和2 個gyrB 編碼的gyrB 亞基組成的四聚體,其中任何一個亞基的突變都有可能造成喹諾酮類藥物耐藥。喹諾酮決定區(qū)域位于第67～106 位氨基酸［5］,其中第83 位絲氨酸的極性對確定細菌對喹諾酮藥物敏感性非常重要［11］。本文43 株肺炎克雷伯菌耐喹諾酮菌株均出現(xiàn)了gyrA 亞基第83 位氨基酸的改變,Ser83→Ala 或Ser83→Thr,這一結(jié)果與國內(nèi)其他研究者如徐陶等［12］存在不同,可能由菌株流行的地域差異導致,由極性氨基酸絲氨酸變成了非極性氨基酸丙氨酸,使第83 位位點親水性降低,DNA 回旋酶與喹諾酮類藥物親和力下降,從而表現(xiàn)為對該類藥物耐藥［3］。本文中有20 株肺炎克雷伯菌發(fā)生了極性氨基酸絲氨酸→蘇氨酸的突變,提示gyrA 基因突變與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的獲得相關(guān),是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生多重耐藥的主要機制之一［13］。

除了本文中研究的gyrA 基因突變與肺炎克雷菌耐喹諾酮株耐藥機制相關(guān),質(zhì)粒介導的水平傳播亦可造成菌株對喹諾酮類藥物耐藥,由質(zhì)粒介導的ESBLs 基因、AmpC 酶基因和喹諾酮類藥物耐藥基因可能存在同一質(zhì)?；蛲晦D(zhuǎn)移元件中,攜帶多種耐藥基因的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移元件水平傳播,可能造成對一種藥物耐藥的同時,伴隨著其他藥物也呈現(xiàn)高耐藥表達,這些問題課題組將在下一階段研究中證實。

綜上所述,肺炎克雷伯菌的喹諾酮類耐藥株gyrA基因突變非常普遍,監(jiān)測其突變頻率及特點對研究喹諾酮類耐藥機制和指導臨床合理用藥非常必要。