咪達(dá)唑侖調(diào)控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖及凋亡的影響

舒蕤 趙立芳 彭井印 張如意

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，山東 濱州 256603)

腦缺血再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖、凋亡異常是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要原因之一，因而如何減輕腦缺血再灌注損傷成為研究重點(diǎn)〔1～3〕。咪達(dá)唑侖屬于γ氨基丁酸受體激動(dòng)劑，其具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮等作用，咪達(dá)唑侖通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷〔4〕。但咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的影響及其可能作用機(jī)制尚未闡明。miR-214-3p在阿爾茨海默病中表達(dá)水平降低，并可通過(guò)抑制自噬而減輕認(rèn)知障礙〔5〕。miR-214可調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號(hào)通路而參與口腔癌的發(fā)生過(guò)程，已有研究表明MAPK/ERK-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)通路被激活后可促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡而造成細(xì)胞損傷〔6，7〕。但咪達(dá)唑侖是否可通過(guò)調(diào)控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而減輕腦缺血再灌注損傷尚未可知。本研究采用缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對(duì)miR-214/MAPK/ERK-CREB通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 咪達(dá)唑侖購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000、凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MAPK/ERK-CREB通路抑制劑PD98059(母液20 mg/ml)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；anti-miR-con、anti-miR-214購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自廣州勞斯生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗鼠MAPK、p-ERK、p-CREB抗體與IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞置于密閉缺氧的培養(yǎng)箱內(nèi)(95% N2、5%CO2)缺氧處理4 h，將其轉(zhuǎn)移至37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2正常培養(yǎng)箱復(fù)氧處理24 h〔8〕，記為缺氧復(fù)氧組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為NC組。大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞加入含有不同濃度(3、6、12 μmol/ml)咪達(dá)唑侖的培養(yǎng)基處理24 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理〔9〕，分別記為3、6、12 μmol/ml咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組。anti-miR-con、anti-miR-214分別轉(zhuǎn)染入大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞后加入12 μmol/ml咪達(dá)唑侖處理24 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，分別記為12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組。anti-miR-214轉(zhuǎn)染入大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞后加入12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖與50 μmol/L抑制劑PD98059處理24 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理〔10〕，記為PD98059+12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種于96孔板(150 μl/孔)，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A值)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，將500 μl結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞沉淀后分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，振蕩搖晃孵育10 min后應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平 收集各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞后采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-214相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測(cè)MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育一抗稀釋液(1∶1 000)過(guò)夜，TBST洗滌，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響 與NC組比較，缺氧復(fù)氧組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與缺氧復(fù)氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2不同濃度咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，缺氧復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復(fù)氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1、圖2。

2.3不同濃度咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中miR-214表達(dá)水平的影響 與NC組比較，缺氧復(fù)氧組miR-214的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復(fù)氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組miR-214表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性、凋亡和細(xì)胞中miR-214表達(dá)水平的影響

1～5：對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組、3 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組、6 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組；圖2同

圖2 Western印跡檢測(cè)各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.4下調(diào)miR-214表達(dá)抑制咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響 與12 μmol/ml咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

2.5缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MAPK/ERK-CRE通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與NC組比較，缺氧復(fù)氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與缺氧復(fù)氧組比較，12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

1，2：12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組

表2 下調(diào)miR-214表達(dá)抑制咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響

表3 缺氧復(fù)氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MAPK/ERK-CRE通路相關(guān)蛋白表達(dá)

1～5：對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組

2.6抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)miR-214下調(diào)表達(dá)對(duì)咪達(dá)唑侖處理的缺氧復(fù)氧大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響 與12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組比較，PD98059+12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表4。

1，2：12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組、PD98059+12 μmol/ml 咪達(dá)唑侖+缺氧復(fù)氧+anti-miR-214組

表4 抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)miR-214下調(diào)表達(dá)對(duì)咪達(dá)唑侖處理的缺氧復(fù)氧大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響

3 討 論

咪達(dá)唑侖可減輕脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷而對(duì)肝臟組織發(fā)揮保護(hù)作用〔11〕。咪達(dá)唑侖可通過(guò)調(diào)控JNK-ERK途徑而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷〔12〕。本研究結(jié)果提示,咪達(dá)唑侖可促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔13〕，咪達(dá)唑侖可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果提示，咪達(dá)唑侖可能通過(guò)上調(diào)miR-214的表達(dá)而減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。研究表明，miR-214在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥、急性腎損傷等疾病中表達(dá)異常，還可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷〔14～16〕。本研究結(jié)果提示，抑制miR-214表達(dá)可拮抗咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖及凋亡的作用。MAPK家族成員的作用為將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，其與ERK1/2在海馬區(qū)可發(fā)揮重要調(diào)控作用，ERK通路激活后可促進(jìn)CREB發(fā)生磷酸化而調(diào)控神經(jīng)元增殖及凋亡等過(guò)程〔17，18〕。本研究結(jié)果提示，咪達(dá)唑侖可能通過(guò)調(diào)控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而發(fā)揮作用。同時(shí)，本研究為進(jìn)一步證實(shí)上述猜測(cè)，將MAPK/ERK-CREB通路抑制劑與miR-214抑制劑添加至缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，結(jié)果提示咪達(dá)唑侖可通過(guò)促進(jìn)miR-214的表達(dá)而抑制MAPK/ERK-CREB通路從而發(fā)揮作用。

綜上，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平降低，咪達(dá)唑侖可促進(jìn)miR-214的表達(dá)而促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制MAPK/ERK-CREB通路的活化有關(guān)。