基于Notch1/Hes1信號通路探討葛根素對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)的影響

張馳 徐莉 任浩進(jìn) 徐超 劉金華 王麗岳

(武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081)

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，心肌梗死發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞的首要表現(xiàn)就是壞死，但根據(jù)最新試驗(yàn)證實(shí)，長時(shí)間缺血會(huì)使心肌細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡的一系列特征，隨后發(fā)生壞死〔1〕。心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生區(qū)域包括梗死中心區(qū)、邊緣區(qū)甚至涉及遠(yuǎn)處的存活心肌細(xì)胞。持續(xù)進(jìn)行的細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性心肌細(xì)胞丟失、細(xì)胞中膠原支架斷開及心室壁的厚度下調(diào)，發(fā)生心室重構(gòu)最終演變?yōu)樾乃?。?xì)胞凋亡過程受多基因的共同調(diào)控，B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)分別是促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性基因，與凋亡過程相關(guān)〔2〕。葛根素屬于中藥葛根中的一種異黃酮化合物，其藥理作用廣泛，抑炎、抗凋亡、抗氧化及調(diào)節(jié)血管舒張等，被認(rèn)為是能夠用于治療心肌梗死、心絞痛、冠心病等一系列心血管病的藥用有效成分〔3～5〕。而目前，葛根素對于心梗造模大鼠的心臟一系列功能的影響和涉及的生物學(xué)機(jī)制尚不明確。缺刻基因(Notch)1/發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(Hes)1信號通路屬于一條保守進(jìn)化的生物胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)其對于細(xì)胞增殖、生長、分化和組織器官發(fā)育發(fā)揮一定作用，該通路活化也與多種炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)過程密切相關(guān)〔6～8〕。有研究指出，激活Notch1/Hes1通路能夠具有心肌保護(hù)效應(yīng)，而其是否參與了心肌梗死中的心肌保護(hù)過程未見相關(guān)報(bào)道〔9〕。本研究建立心肌梗死大鼠模型，基于Notch1/Hes1信號通路探討葛根素對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 雄性Wistar大鼠(購自中國科學(xué)院生物研究所)、葛根素(購自四川玉鑫藥業(yè)有限公司)、戊巴比妥(購自陜西漢江藥業(yè)股份有限公司)、HE染液(索萊寶科技有限公司)、Notch1的胞內(nèi)片段(NICD)一抗及二抗、Hes1一抗及二抗、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)一抗及二抗、p-蛋白激酶B(Akt)一抗及二抗、Bcl-2一抗及二抗、Bax一抗及二抗(購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司)、原位末端缺刻標(biāo)記法(TUNEL)檢測試劑盒(購自武漢普健生物科技有限公司)、蛋白酶K(購自武漢普健生物科技有限公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑(購自上海雙贏生物科技有限公司)。

1.2模型制備 制備心肌梗死大鼠模型時(shí)，首先使用3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊巴比妥(劑量為40 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，進(jìn)行口氣管固定之后連接呼吸機(jī)，從大鼠的左側(cè)3～ 4肋骨間一步步打開胸腔及心包，待心臟暴露出來，使用絲線對大鼠冠脈前降支進(jìn)行結(jié)扎，通過心電圖可以觀察到ST段明顯抬高，心臟左室前壁發(fā)白，模型建造成功后，使肺部完全膨脹，排出胸腔的氣體進(jìn)行胸腔關(guān)閉。

1.3分組 將96只雄性Wistar大鼠(200～250 g)隨機(jī)分成3組：對照組：進(jìn)行假手術(shù)，穿線操作相同但不進(jìn)行結(jié)扎；模型組：按照模型制備操作結(jié)扎大鼠心臟冠脈；葛根素干預(yù)組：同模型組進(jìn)行模型制備后24 h進(jìn)行腹腔注射葛根素120 mg/(kg· d)，對照組和模型組均腹腔注射與其等量的生理鹽水，1次/d。3組按照術(shù)后1、2、3、4 w記錄各時(shí)間點(diǎn)血液流變學(xué)指標(biāo)后處死大鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。

1.4血液流變學(xué)指標(biāo)檢測 對大鼠麻醉處理固定后進(jìn)行右頸總動(dòng)脈的分離，插入PE-50導(dǎo)管于頸部總動(dòng)脈，待數(shù)值穩(wěn)定觀察動(dòng)脈收縮壓(SBP)，再將導(dǎo)管移入左心室，通過BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對左室舒張末期壓(LVEDP)、左室壓上升(下降)最大速率(±dp/dt max)進(jìn)行測量。

1.5大鼠心臟質(zhì)量和心肌梗死面積檢測 各組大鼠處死后得到心臟，使用0.85%氯化鈉洗滌吸干水分后進(jìn)行全心重量(THW)、左心室的實(shí)際重量(LVW)稱量，分別除以大鼠整體體重(BW)，兩者比值能夠提示全心、左心室肥厚程度。沿左室長軸的垂直線將其均分4份，每一份中選取5 μm心臟組織行蘇木素-伊紅(HE)染色，成像后進(jìn)行分析，取心內(nèi)、外膜表面的梗死瘢痕弧長和心內(nèi)、外膜表面周長的均值。心肌梗死面積=(瘢痕外弧長+瘢痕內(nèi)弧長)/(內(nèi)周長+外周長)× 100%。

1.6制備心肌組織切片 各組大鼠處死后得到心臟，濃度為0.85%的氯化鈉進(jìn)行反復(fù)沖洗后再運(yùn)用10%的甲醛進(jìn)行細(xì)胞24 h固定，經(jīng)過石蠟包埋處理對心梗病灶周圍1 mm以內(nèi)的心肌組織沿左室軸線進(jìn)行4 μm厚石蠟切片處理，進(jìn)行HE染色顯微鏡下觀察，并通過Western印跡法檢測Notch1/Hes1信號通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

1.7檢測心肌細(xì)胞凋亡 通過TUNEL選取各組切片各5張，按照TUNEL試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。首先進(jìn)行固定包埋切片，隨后脫蠟處理，運(yùn)用H2O2封閉處理0.5 h，使用濃度為25 mg/L的蛋白酶K對膜、核蛋白進(jìn)行消化，再向其中加入一定量的TUNEL反應(yīng)液，室溫條件下孵育1 h，添加抗熒光素抗體及DAB顯色試劑，經(jīng)過蘇木素復(fù)染、脫水、透明操作后進(jìn)行封片。在400倍視野觀察每張切片的5個(gè)不同視野總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡數(shù)目，凋亡系數(shù)=細(xì)胞凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1心肌梗死大鼠模型的制備結(jié)果 建立心肌梗死大鼠模型后，大鼠的整體死亡率為34.50%，模型組死亡率為16.50%，葛根素干預(yù)組死亡率為14.80%，模型組和葛根素干預(yù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，模型制備結(jié)束后對模型組大鼠進(jìn)行開胸檢查發(fā)現(xiàn)心臟肥大，左心室的游離壁上一部分心臟肌肉變薄、發(fā)白，同時(shí)可見心肌梗死灶存在。見圖1。

A：大致觀察；B：光學(xué)顯微鏡下觀察(×200)，箭頭指向心肌梗死灶

2.2各組血液流變學(xué)指標(biāo) 模型組及葛根素干預(yù)組血液LVEDP較相同時(shí)間的對照組顯著上升(P<0.05)，±dp/dt max及SBP則明顯下調(diào)(P<0.05)。3 w時(shí)，葛根素干預(yù)組+dp/dt max和SBP較相同時(shí)間的模型組顯著上升(P<0.05)，LVEDP則明顯下降(P<0.05)；2 w時(shí)，葛根素干預(yù)組-dp/dt max較相同時(shí)間的模型組顯著上升(P<0.05)。見表1。

2.3各組心肌梗死面積及左心室重量比較 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組BW無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，模型組和葛根素干預(yù)組心肌梗死面積差異顯著(P<0.05)。術(shù)后4 w時(shí)，模型組THW/BW、LVW/BW數(shù)值較對照組顯著上升(P<0.01)，使用葛根素干預(yù)可以顯著削減心肌梗死模型大鼠左心室肥大現(xiàn)象(P<0.05)。見表2。

表1 各組血液LVEDP、SBP、+dp/dt max、-dp/dt max比較

表2 各組心梗面積及左心室重量的比較

2.4各組心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下不同程度染色的棕褐色代表凋亡心肌細(xì)胞核，輪廓清晰，藍(lán)色染色的代表正常心肌細(xì)胞核，而心肌壞死細(xì)胞的輪廓結(jié)構(gòu)不清晰。術(shù)后1 w對照組心肌梗死灶附近未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，葛根素干預(yù)組及模型組均出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，葛根素干預(yù)組心肌凋亡細(xì)胞核數(shù)比模型組顯著下調(diào)，凋亡著色變淺。葛根素干預(yù)組心肌梗死灶附近的凋亡心肌細(xì)胞均比相同時(shí)間點(diǎn)模型組顯著下降(P<0.01)。見圖2、表3。

圖2 手術(shù)后1 w各組心肌細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL染色，×400)

表3 不同時(shí)間模型組和葛根素干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡系數(shù)對比

2.5各組Bax/Bcl-2比值隨時(shí)間的變化 術(shù)后1、3、4 w時(shí)，模型組Bax/Bcl-2數(shù)值較相同時(shí)間的對照組顯著上升(P<0.05)，術(shù)后3、4 w時(shí)，模型組的Bax/Bcl-2數(shù)值較同組術(shù)后1 w時(shí)顯著上升，且4 w時(shí)上升更加顯著(P<0.05)，4 w時(shí)，葛根素干預(yù)組Bax/Bcl-2數(shù)值較模型組顯著下降(P<0.05)。見表4。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2變化

2.6各組Notch1/Hes1信號通路蛋白表達(dá)比較 干預(yù)4 w后，模型組心肌組織中的NICD、Hes1及PTEN蛋白及p-Akt表達(dá)與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；葛根素干預(yù)組心肌組織中的NICD、Hes1、p-Akt/Akt、PTEN蛋白表達(dá)均與對照組和模型組存在顯著性差異(均P<0.01)。見表5、圖3。

表5 各組干預(yù)4 w后Notch1/Hes1信號通路蛋白表達(dá)比較

圖3 各組Notch1/Hes1信號通路蛋白表達(dá)比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死主要病理機(jī)制涉及冠狀動(dòng)脈閉塞所引發(fā)的心肌組織缺氧及缺血。心肌梗死也是導(dǎo)致心臟功能損傷的主要原因，嚴(yán)重情況下會(huì)使患者在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生死亡。心肌梗死的病理表現(xiàn)同時(shí)包括心肌大面積壞死及心肌收縮力減弱，從而導(dǎo)致供血不足及其他惡性并發(fā)癥的發(fā)生，對于患者的生活品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。所以，對于防治心肌梗死的相關(guān)課題一直是學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)〔10～12〕。心肌梗死一般會(huì)在急性缺血期出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，并且在亞急性、慢性期丟失存活細(xì)胞，以上現(xiàn)象主要與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡后會(huì)被纖維組織及成纖維細(xì)胞取代，促進(jìn)了心力衰竭的進(jìn)展及心功能減退。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制心肌梗死模型鼠的心肌細(xì)胞凋亡能夠顯著改善心臟功能，抑制心肌細(xì)胞的病理變化，同時(shí)顯著阻止心肌的受損〔13〕。所以，控制心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡將會(huì)是治療心肌梗死的可行性方法。葛根素屬于傳統(tǒng)中草藥葛根中的重要活性成分，其多重藥理活性包括促進(jìn)血流微循環(huán)、舒張血管、抗感染、抗氧化及抗凋亡等，所以其在高血壓、心臟病、心絞痛、心肌受損等一系列心血管病中能夠發(fā)揮重要作用〔14〕。有研究報(bào)道指出，葛根素能夠顯著抑制慢性心衰模型大鼠的心肌炎癥及心肌細(xì)胞凋亡，明顯提高模型鼠生存率并改善心功能。另外有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠顯著控制糖尿病模型鼠被誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，控制心肌梗死面積從而進(jìn)行對心臟的保護(hù)作用〔15〕。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死發(fā)生之后，心肌梗死的周邊區(qū)域細(xì)胞凋亡顯著。本次研究結(jié)果提示，葛根素于早期即能夠保護(hù)一部分心肌，細(xì)胞凋亡數(shù)隨時(shí)間推移顯著下調(diào)。凋亡過程是受相關(guān)基因調(diào)控的，激發(fā)、抑制均受不同基因的控制，Bax、Bcl-2基因分別促進(jìn)和抑制細(xì)胞的凋亡。Bcl-2/Bax數(shù)值即能夠體現(xiàn)細(xì)胞存亡，Bcl-2蛋白水平的上調(diào)會(huì)使Bax/Bcl-2下調(diào)，表明細(xì)胞凋亡被抑制，細(xì)胞能夠存活，相反，Bax蛋白的過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞死亡〔16～18〕。本研究結(jié)果提示，心肌細(xì)胞缺血受損時(shí)Bcl-2馬上被啟動(dòng)，Bcl-2基因產(chǎn)物能夠逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞凋亡過程，對心肌梗死中的存活細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，心肌梗死的慢性時(shí)期，增生膠原纖維促使梗死附近的心肌組織缺氧、缺血，誘導(dǎo)了凋亡發(fā)生過程，促進(jìn)Bax的表達(dá)過度。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素主要在后期抑制細(xì)胞凋亡，并且隨時(shí)間推移，心肌細(xì)胞凋亡顯著下降。

心肌梗死發(fā)生時(shí)的心室重構(gòu)過程屬于心臟對血液流變學(xué)變化的代償反應(yīng)，阻止細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞進(jìn)行丟失概率，會(huì)顯著改善左心室的功能〔19～21〕。本研究表明，心臟的彈性功能受到明顯損傷，提示葛根素在后期發(fā)揮主要作用，下調(diào)左室的充盈壓，進(jìn)行左心室功能改善。本研究結(jié)果提示，心肌梗死的面積大小取決于心梗發(fā)生的開始短時(shí)期，葛根素作為中藥成分可能藥效作用緩慢。同時(shí)，長時(shí)間運(yùn)用葛根素干預(yù)能夠減輕全心、左心肥大，心室重構(gòu)過程得到抑制。此外，葛根素干預(yù)能夠明顯激活Notch1/Hes1信號通路的表達(dá)。

綜上，心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象，并且伴隨左心室功能降低，使用葛根素進(jìn)行干預(yù)能夠通過促進(jìn)Bcl-2抑制Bax基因的表達(dá)一定程度上減輕心肌細(xì)胞凋亡，有助于左心室功能改善以及減輕心室重構(gòu)，這些過程與其激活Notch1/Hes1信號通路的表達(dá)密切相關(guān)。